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メチルグリーンの濃度 削除/引用 No.80-15 - 2007/09/05 (水) 12:19:08 - 免染 レスが大変遅くなって申し訳ありません。 緩衝液中のメチルグリーンの濃度は１％でやっていました。 うちの今のボスは色盲なので、DAB-メチルグリーンだと赤系の色と緑の組み合わせだと見えづらいそうです。

(無題) 削除/引用 No.80-14 - 2007/08/28 (火) 05:29:43 - sea 賦活化した切片をメチルグリーンで染めろって強制するボスは ちょっとナンセンスな気がしますが・・ 私なら以下のような対応です。 (1) 賦活化していない切片でメチルグリーンがきれいに染まり、賦活化した切片では染まらない場合 (1-1) 賦活化した切片ではメチルグリーンが染まらないことは周知の事実であることをボスに告げて(「酵素抗体法」にも明記されています)ラボとして対比染色をどうするのか方針を決めてもらう (1-2) 可能であればカルノアなど、ホルマリン系じゃない固定液で目的の蛋白が染まるか試してみる。カルノアの場合は賦活はしませんから、メチルグリーンもよく染まります。 (2) 賦活化していない切片でもメチルグリーンがムラになる場合 (2-1) メチルグリーン溶液自体が不均一である可能性はありますが、記載を見る限り大丈夫そうです。そんなときはサンプルをドーゼに入れたときに均一にサンプルにいきわたるようにシャカシャカとサンプルかごを振る。そのあとの洗浄も同様にシャカシャカとよく洗う。こんな感じです。 あとはメチルグリーンは用事調整にしないと徐々にへたりますので、その場合は反応時間も検討するか、新しいものを用意するかなどが必要になります。 (2-2) それでも賦活化した切片に関しては(1)と同様です。

(無題) 削除/引用 No.80-13 - 2007/08/27 (月) 18:23:03 - iku 免染さん、ありがとうございます。 メチルグリーンが嫌いなボス。。。いいですね!! 一度ヘマトで染めてみたんですが、やはり否定されてしまいました。。。 そのためマイクロウェーブ処理をした切片でも頑張ってメチルグリーンでの染色にチャレンジし続けているのですが、良い結果がでずなかばあきらめかけていました。 ベロナ-ル緩衝液、クエン酸緩衝液で溶解させて行ってみます。 ちなみに、基本的な質問かもしれないのですが、濃度はどのくらいものを使用したらよいのでしょうか？

メチルグリーン 削除/引用 No.80-12 - 2007/08/25 (土) 16:05:09 - 免染 もうあらかた解決したようですが、一応。 メチルグリーンは私の知る限りベロナール緩衝液やクエン酸緩衝液に溶解して使用しております。水よりはこっちの方がいいんじゃないでしょうか？ DAKOからはすでにワーキングソリューションとなったものを販売しておりますが、こういうものを使用してみてはいかがでしょうか？ それでも熱処理したものは染まりませんけどね。私はO/Nで無理矢理染めてましたけど。核が染まるタイプの抗原でなければヘマトキシリンでやってしまってもいいんじゃないかと思います。 ちなみに今の私のボスはメチルグリーン大嫌いなので私は今現在使えません・・・

(無題) 削除/引用 No.80-11 - 2007/08/23 (木) 17:08:47 - iku どの質問に対してもとても丁寧に答えてくださり、本当に本当にありがとうございました!! とてもすっきりしました。 現在私は数種類の抗体を用いて染色しているので、賦活化ありとなしの両方の染色を行っています。 くだんさんの奨めてくださった酵素抗体法の本いますぐ買います!!!

(無題) 削除/引用 No.80-10 - 2007/08/23 (木) 12:52:54 - くだん 以下に質問を答えますよ。 その前に聞きたいのですが、結局賦活化処理してるんですか、してないんですか。それによって、僕の返答は見当はずれになってしまいます。 ・実はヘマトキシリンでの核染も考えたことがあるのですが、文献では１５秒程度の短時間でと書いているのに、過去に染色されたことのある方（病院の検査技師さん）からは１時間程度染色すると聞きどちらが正しいのか分からず保留にしている状態です。 ↑ どちらも正しいです。目的によって違いますよ。対比染色の場合は数秒から十数秒位で、普通のＨＥ染色の場合は、染色液の状態によりますが、20分位じゃないですかね。 ・またヘマトキシリンの方が染色方法が難しいというようなことも聞き、メチルグリーンに専念するほうが早いのかなと思っていたのですが、実際はどうなんでしょうか？ ↑ ヘマトキシリン染色は難しくないですよ。って言うか、最も一般的な方法じゃないでしょうか。 メチルグリーンは遮光していてもメチルバイオレットに変化するので、適宜クロロホルムで分離が必要云々。。ってありますよね。メチルグリーンの方が、保存とか面倒じゃないですか。 ・あとボスがメチルグリーンでの染色が好みらしいことがかなりひっかかっていて。。。 ↑ メチルグリーンはキレイですよね。でも現在賦活化している、或いは賦活化が必要だと仮定すると、先のメールの理由から、メチルグリーン染色は原理的に無理なので、好みとかそういう問題じゃないですよね。 くどいですが、現在賦活化しているとして、今ikuさんがしている免染には賦活化処理は必要なんですかね？ もし必要ないなら、止めればメチルグリーンでも染まりますよね。 ・ちなみに、メチルグリーン染色した切片からヘマトキシリンに染色しなおすことは可能ですか？ ↑ やったことないですけど、出来るんじゃないですかね。 メチルグリーンは水溶性ですから、水に切片を漬けておけば、完全には無理でしょうけどある程度色が落ちると思います。 その後ヘマトキシリンで染めればいいんじゃないですかね。やってみて下さい。 ＊「酵素抗体法」っていう本持ってますか。上記の様な内容は全て、もっと詳しく載ってますので、もし持っていないのならすぐ手に入れてください。 免疫染色するなら必須の本です。こちらのＨＰの本の紹介の所にも出てますよ。

(無題) 削除/引用 No.80-9 - 2007/08/22 (水) 19:52:58 - iku くだんさんありがとうございます。 実はヘマトキシリンでの核染も考えたことがあるのですが、文献では１５秒程度の短時間でと書いているのに、過去に染色されたことのある方（病院の検査技師さん）からは１時間程度染色すると聞きどちらが正しいのか分からず保留にしている状態です。 またヘマトキシリンの方が染色方法が難しいというようなことも聞き、メチルグリーンに専念するほうが早いのかなと思っていたのですが、実際はどうなんでしょうか？ あとボスがメチルグリーンでの染色が好みらしいことがかなりひっかかっていて。。。 ちなみに、メチルグリーン染色した切片からヘマトキシリンに染色しなおすことは可能ですか？

賦活化のせいでは？ 削除/引用 No.80-8 - 2007/08/22 (水) 11:51:25 - くだん 横から失礼します。 免染との事なので、切片を電子レンジやオートクレーブで賦活化していませんか。 詳しい原理は忘れましたが、確かメチルグリーンは二本鎖DNAを検出します。 そのため賦活化の加熱処理により、一本鎖になったDNAは検出できないので、核は染まらないか、ムラになるはずです。 むしろ、賦活化をしているのに核がメチルグリーンでバッチリ染まったら、賦活化が上手くいってないと言う事で、そちらの方がマズいです。 上記の様な事であれば、核はヘマトキシリンで染めれば良いと思います。 また上記の確認方法としては、賦活化してない切片をメチルグリーンで染めて、核が染まれば、賦活化が原因であると言えると思います。

(無題) 削除/引用 No.80-7 - 2007/08/22 (水) 11:11:46 - iku こちらこそすみません!! 思い切り勘違いしていました。。 染色時間をのばして切片になじませるようにゆらしながら染色を行ってみます。

(無題) 削除/引用 No.80-6 - 2007/08/21 (火) 21:02:34 - 組織 説明不足でした。 滴下だと、液が少なめのときに周囲が濃く染まるかもしれないということです。 漬け込み式のほうがむらは防ぎやすいと思います。 染色時間が数秒と短いので、なるべく液を切片になじませてやった方が良いと思います。 切片上に前の液（純水？）が残っていると、濃度差が生じ、むらができやすいと思います。 染色液を入れてるジャーを揺らすか、切片を一枚ずつ入れ染色液中で混ぜるなりしてみてはどうでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.80-5 - 2007/08/21 (火) 18:49:35 - iku ドーゼに入れた染色液に浸して染してました。 ぜひぜひ滴下での染色方法を試みたいのですが、 滴下したあと、何分何秒程度染色液をのせ、どのように脱色していけばいいのでしょうか？ 今まで行っていた方法は、染色液に数秒浸してすぐにブタノールで脱色し、キシレンでその後封入していたのですが、同様の方法で大丈夫ですか？

(無題) 削除/引用 No.80-4 - 2007/08/21 (火) 18:36:11 - 組織 メチルグリーンは切片に滴下してますか？それとも切片を液に漬けこんでますか？ 滴下だと液の中心と周りで染まりむらが出るかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.80-3 - 2007/08/21 (火) 17:21:36 - iku 先生が薄切してくださったので、切片自体にはムラはないと思います。。 メチルグリーンの溶液の組成は、蒸留水＋メチルグリーン試薬の１％溶液（合計１５０〜２００mℓ）を使用しています。 あと使用前にろ過をしています。 抗体での染色自体は比較的きれいな染色ができているので問題ありません。 よろしくお願いします。

メチルグリーン 削除/引用 No.80-2 - 2007/08/20 (月) 10:08:53 - 免染 メチルグリーン溶液の組成について教えて下さい。 それと、切片そのものにムラはありませんか？メチルグリーン以外の染色についてはうまくいっていますか？

免染の核染色 削除/引用 No.80-1 - 2007/08/19 (日) 19:00:03 - iku 大学院１年目の学生です。 最近パラフィンブロックでの免染をはじめたのですが、 どうしてもメチル緑での核染色がうまくいきません。。。 何度おこなっても染色むらになってしまい、何回も繰り返す結果切片がはがれてきてしまうありさまです。 どうしたらいいのか分かりません。。。 どなたかなにかアドバイスがありましたら教えていただけないでしょうか。 よろしくお願いします。

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