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難しいですね。 削除/引用 No.5-4 - 2007/07/27 (金) 17:40:57 - fish PGL3さんに示して頂いた論文を見ましたが、proximal promoterを用いたTgマウスでほぼ完全な組織特異性を示しますので、500bpで十分のようですね。 しかし、in vitroの系では、コントロールのpGL3basicに比べて10倍程度しか上昇しませんので、この細胞でLA2000を用いた系ではこれが限界のようです。私の印象ではTgで完全に組織特異性を出せるようなpromoterはin vitroで大きな活性を示す印象だったのですが、そうでない場合もあるようですね。 あと、論文は500bp以内の3ヶ所がhot regionであり、そのうちのいづれのregionにmutationを入れてもbaseの活性が減少するという内容だと思います。実際deletion studyでも、500bpから280bpの配列を削ると活性が減少しています。しかし、PGL3さんの場合は、むしろ200bpで最大の活性を示すようですので、その部分では論文の再現がとれないのでしょうか？こうなると非常に難しいですね。配列も読まれて、論文と一致させておられるようですし・・ 目的にもよると思いますが、私なら悩むのが嫌なので、論文の著者にplasmidを供与してもらい再現実験を行います。で再現がとれるようであるならそのplasmidを使用します。駄目であれば、plasmid以外に問題があると考えます。もし論文にTgのdataがなければ、BACを用いてより長いpromoterを取る事を考えるのですが・・ 長文申し訳ないです。私も同じ様なテーマで、同様の問題を抱えています。参考になればよいのですが。。

(無題) 削除/引用 No.5-3 - 2007/07/27 (金) 16:12:06 - PGL3 fish様、ご返事ありがとうございます。 周りに聞ける人が居ないのですごく助かります。 ＞私の研究室でも、pGL3basicを用いたpromoter assayを行っていますが、種々の長さの ＞promoter活性を比較する場合には、必ず同時調整で全てのplasmidを調整しなおして ＞transfectionすることに＞なっています。 なるほど、そういうこともあるのですね。本実験ではコンストラクトは同時調整です（Miniprep）ので安心しました。 ＞あと、個人的な印象ですが、pGL3さんの場合はかなりpromoter活性が低いので、800bpでは長＞さが足りないのかなと思います。細胞にもよりますが、通常のpromoterをpGL3basicにつなげ＞ると、pGL3basicよりもかなり高い活性を示すはずです。従って、800bpでpGL3basicと同程度＞のvalueなら、より上流に強いenhancerが存在するのかなと勝手に想像しました。参考になれば＞よいのですが。。 実はこの点に関してはfish様と私も同感なのです。しかしながらこの実験におけるgeneは-800より上流はAluや繰り返し配列のクラスターが-5000くらいまで存在しいます。これを主な理由として既にpublishされた論文では800bpのコンストラクトが用いられており、またcitationも多数存在しています。当初、私も2000bpのコンストラクトのクローニングをかなりトライしましたが取ることができませんでした。そこで今回、800bpの使用に踏み切りました。今までのところ、800bpを幾つか削って数種のコンストラクトをテストした論文はまだ存在していません（学会などのポスター発表ではあるのかもしれません、未確認）。また、本実験の、”800bpのコンストラクトの活性は弱い”という結果は既にpublishされた論文とほぼ一致しています。 長くなってしまいましたが、”artifact”というラインは取りあえず横に置いといて、（Rivkees S et al, JBC, 14204-14209, 1999）のFig.3のように進めてみるべきでしょうか？

Luciferaseのbaseのvalueは 削除/引用 No.5-2 - 2007/07/27 (金) 15:07:22 - fish plasmidのlotによってある程度値が変わります。 つまり、同じplasmidであっても、調整時(Maxi prep等)の不純物の持ち込みに差がある場合はLucuferae activityに違いが生じるということです。 私の研究室でも、pGL3basicを用いたpromoter assayを行っていますが、種々の長さのpromoter活性を比較する場合には、必ず同時調整で全てのplasmidを調整しなおしてtransfectionすることになっています。 あと、個人的な印象ですが、pGL3さんの場合はかなりpromoter活性が低いので、800bpでは長さが足りないのかなと思います。細胞にもよりますが、通常のpromoterをpGL3basicにつなげると、pGL3basicよりもかなり高い活性を示すはずです。従って、800bpでpGL3basicと同程度のvalueなら、より上流に強いenhancerが存在するのかなと勝手に想像しました。参考になればよいのですが。。

レポーターアッセイ 削除/引用 No.5-1 - 2007/07/27 (金) 14:38:05 - PGL3 レポーターアッセイのために下記のコンストラクト(1〜5)を作製しアッセイしました。 1. -800/+30-Luc 2. -600/+30-Luc 3. -300/+30-Luc 4. -200/+30-Luc 5. -100/+30-Luc 6. pGL3-basic -200/+30-Luc以外のコンストラクトではpGL3-basicとほぼ同値なのですが、-200/+30-LucではpGL3-basictの７倍の値を示しました。Lucの値が-800/+30-Luc＞-600/+30-Luc＞-300/+30-Luc＞-200/+30-Lucのようなパターンであればリーゾナブルだと思うのですが、この結果は単なる“artifact”である可能性が高いと考えるべきでしょうか？ どなたかご教示お願い致します。 （追）インサートはPCRによる増幅後、TAクローニングし、EcoRIで切り出し平滑化してpGL-basicのSma Iに組み込みました。クローンは全てsequnceを確認しています。Transfection効率はphRL-TKをco-transfectionすることで補正しています。実験は再現性があります。尚、trnasfection後、薬剤による刺激はしていません。

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