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(無題) 削除/引用 No.341-4 - 2007/10/17 (水) 21:44:20 - カナマイシン 当方、ビオチンではやったことないんですが･･･ 同じプローブなのにやる回ごとに違う、ということは、 1. 入れるフリープローブの希釈がまちまちである。 2. メンブレン転写が安定しない。 を思い浮かべます。 2. だとして･･･ 膜転写はエレクトロブロッティングですか？ どのような条件でやられてますか？ 不足すると転写しないし、過剰だと膜を突き抜けてしまいます。 私自身は経験がないですが、ブロッティング装置の電極は劣化するそうです。 同じマシンを使って他のメンバーは成功してますか？ それから、マイナス電極-濾紙とかゲルとかメンブレンとか-プラス電極　の３点の間は しっかり密着してますか？　うちにあるマシンはうまくバランスを取らないと３点が 密着せず、電気がほとんど流れません （定電圧なら電流を、定電流なら電圧をチェックしておくといいと思います）。 「うまくいかない」とはどのようなことですか？ バンドシフトの再現性が取れない？ ポジコンすらシフトしない？ ポジコンはシフトするけど自分で「結合するだろう」と確信してるサンプルがシフトしない？ それ以外？ その辺りを教えていただけるとアドバイスがしやすいかなと思います。

有難うございます。 削除/引用 No.341-3 - 2007/10/17 (水) 18:29:18 - 茨城 ご意見有難うございます。すいません、表現を間違えました。 フリーのﾌﾟﾛｰﾌﾞの件ですが、一枚のメンブレン上ではほぼ均一なのですが、 毎回同じ希釈濃度で行っているのにその時々でフリーﾌﾟﾛｰﾌﾞの濃さが違ったりしています。 標識はビオチンです。サンプル作製の時点で既に失敗しているのかもしれませんが。 　よろしくお願いいたします。

(無題) 削除/引用 No.341-2 - 2007/10/17 (水) 11:05:47 - カナマイシン フリーのプローブがまちまちなのはいただけないですね。 標識法はなんですか？　RI？　DIG？　ビオチン？ まずはフリープローブが揃わないと。 Binding mix をいじるのはその後かなと思います。

in vivoにおけるゲルシフトアッセイ 削除/引用 No.341-1 - 2007/10/16 (火) 23:32:23 - 茨城 はじめまして。研究を始めたばかりの初心者です。 よろしくお願いいたします。 　いま、動物の臓器をサンプルとしてゲルシフトアッセイをしています。ですが、うまくバンドが検出できません。細胞でも同じように行った場合、うまく行くときと行かないときがあります。 　Binding mixを作製するときに色々考えてEDTA,KClなどを加えてみましたがはっきりしません。フリーのﾌﾟﾛｰﾌﾞの量もまちまちです。 全部いけないのかもしれませんが、特にどこがだめなのか良く分りません。ちなみに核抽出はキットを使用しています。 　曖昧な表現で申し訳ないんですが、ご助言よろしくお願いいたします。

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