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(無題) 削除/引用 No.337-6 - 2007/10/17 (水) 14:33:53 - そば 完全長のcDNAを高効率で得たいのであればSMART、5'末端を正確に把握したいのであればGeneRacerという印象でしょうか。 GeneRacer（oligo capping法）であればcap構造によって保護された位置にしかオリゴがライゲーションされないため、より正確な5'末端同定が出来ると考えられますが、一本鎖RNA同士のライゲーション効率がそれほど高くはないようで、検出に若干苦労するかもしれません（手技のせいかもしれませんが）。 一方でSMART法は5'末端にオリゴが付加されたcDNAが高効率で得られるので検出力は高いですが、末端に付加されるpolyCの数が多少変動するため、正確な5'末端を同定するには不向きな印象を受けました。 実験の目的から考えればGeneRacerの方が無難なのではないかと思います。 ただ、発現量その他の条件でSMARTの方が良い場合もあり得るとは思いますが。 ご参考までに。

(無題) 削除/引用 No.337-5 - 2007/10/16 (火) 18:19:12 - 32 ちょっとずつ上に伸ばしていくというのは、5'RACEで新たにわかった配列をもとに新しくGSPを設計してPCR→SEQ解析を繰り返すということです。 cDNAは最初にSMART KITで合成した同じtubeのものを使い続けてました。 これは一度で欲しい領域全てが得られなかった場合ということです。 私は全く未知のものだったのでちょっとずつ5'末端側を読んでいくというやりかたでやりましたが、5'末端側がisoformで同じであるならば、isoformが 釣れてくるのを避けるためには、その3'末端側の特異的配列部分でがんばってprimer設計して欲しい領域すべてを増幅させられるまでがんばる感じになると思います。

(無題) 削除/引用 No.337-4 - 2007/10/16 (火) 15:58:50 - cDNA あいうえお様、32様早速のご返答ありがとうございます。 ＞あいうえお様 Kitは5'-RACEを考えております。 私なりに少し調べてみたのですがRNase Protection Assayの原理は理解できたのですが、アイソフォームの検出はどのように行えばいいのでしょうか？ プローブの配列をずらしていくということでしょうか？ 浅学で申し訳ございません。。。 ＞32様 ちょっとずつ上流に伸ばしていくというのは、最初のFirst-strand cDNA synthesisのところでしょうか？ 私の見たい1つのアイソフォームは特異的配列が3´末側に100bpあり、おそらく上流の配列が1500bのものと200bの2種類あるのではないかと思っています。 しかし、その特異的配列以外はその他のアイソフォームと完全に共通しております。 よって、その特異的配列にPrimerを設計して、そこからしか合成反応を開始させることができないと思っております。 このような場合でも5'RACEは可能でしょうか？ 現在私はあまり時間がなく今から新しい実験系を立ち上げることが困難です。RACEであれば今からでもすぐ出来るので、どうにかこの方法で出来ないかと考えております。

(無題) 削除/引用 No.337-3 - 2007/10/16 (火) 12:53:26 - ３２ SMART RACEを使っています。 私が扱っているサンプルでは、アンカープライマーがリバースプライマーとしても くっつきやすいものが存在するために苦労したことがあります。 GSPの設計とPCR条件の検討で最終的にどうにかなりましたが。 一発でいくものは一発でいきます。 構造上の問題か、RNAの状態か、primerの問題か定かではありませんが ちょっとずつ上流に伸ばしていったものもあります。 （伸ばしたところでまたGSPを設計してアンカープライマーとPCR　を繰り返す。）

(無題) 削除/引用 No.337-2 - 2007/10/16 (火) 10:50:46 - あいうえお ターゲットがヒト・マウス・ラットなど配列既知のもので、 アイソフォームを調べるためだけならば、RNase Protection Assayで 地道にやるのがいいように思います。 挙げてらっしゃるキットは5'-RACEのキットでしょうか？ この方法でどの程度上までのばしていけるかはわかりませんが、 有効かもしれませんね。 ロシュのキットは問題なく使えました。

完全長のcDNAのRACE kit 削除/引用 No.337-1 - 2007/10/15 (月) 18:24:05 - cDNA 完全長のcDNAを得ようとしています。 私が見たいものは、スプライシングバリアントが複数あり、それぞれ最後のエクソンが異なるものです。また、一部のバリアントははっきりと同定されておらず。というかその最後のエクソンから上流の配列の情報が乏しいのが現状です。 私は現在自分の研究範囲である組織での、その一部のバリアントの完全長を同定をしたいと考えております。 そこで、検出方法としてRACE法があると思うのですが、 以上のことをふまえるて自分なりに良いKitはないかと調べてみると以下のものがよいかなと思いました。 ・イン○トロジェン：ジーンレイサー ・クロンテ○ク：スマートレイス しかし、どちらにするか迷っています。 高価なKitなので比較された方はあまりいないかも知れませんが、些細な情報でも構いませんのでご教授お願いします。 他にも良いキットがあるなどありましたらお願いします。

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