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mutation detection kitについて トピック削除
No.327-TOPIC - 2007/10/12 (金) 14:22:35 - No.8
mutation detection kitについて、私はsurveyor mutation detection kitという物を使用し始めました。

mutation部位のみをカットしてくれる非常に便利な酵素のようですので使用してみたのですが、どうもうまくいっていないようです。もし使用している人でトラブルが解決できた方がいるようであれば教えてください。

まず、referenceとtestサンプルを等量混ぜてduplexを作成しここで半分に分けます。半分を試薬で反応させ、半分をアンカットとしました。
そして、反応が終わった後で泳動したのですがアンカットの方は当然バンドが見られるのですが反応させた方のバンドが消えてしまいました。何か原因が分かる方がいれば教えてください。
 
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(無題) 削除/引用
No.327-2 - 2007/10/12 (金) 14:39:13 - AP
当然、説明書に忠実にやっておられるとは思いますが、
私が同様の現象を経験したときは
1)反応時間を、説明書に書いてあるより長くする分にはいいだろうと、1時間くらいにした。
2)反応終了後に付属のstop solutionをいれるのを忘れて、そのまま泳動、保存した。

どうも、この酵素はheteroduplexを切断する活性以外のnuclease活性がかなりあるみたいで、必要最小限の反応にとどめておかないとDNA分解の危険があるようです。

mutation detection kitについて 削除/引用
No.327-1 - 2007/10/12 (金) 14:22:35 - No.8
mutation detection kitについて、私はsurveyor mutation detection kitという物を使用し始めました。

mutation部位のみをカットしてくれる非常に便利な酵素のようですので使用してみたのですが、どうもうまくいっていないようです。もし使用している人でトラブルが解決できた方がいるようであれば教えてください。

まず、referenceとtestサンプルを等量混ぜてduplexを作成しここで半分に分けます。半分を試薬で反応させ、半分をアンカットとしました。
そして、反応が終わった後で泳動したのですがアンカットの方は当然バンドが見られるのですが反応させた方のバンドが消えてしまいました。何か原因が分かる方がいれば教えてください。

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