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Tさんのコメントを見て思い出しましたが 削除/引用 No.291-6 - 2007/10/08 (月) 12:18:44 - taka SDS bufferに8M ureaを添加して、抽出に使用していた人もいました。 SDS耐性の相互作用が・・・・とか言ってました。 この場合、泳動が乱れるので少量しかアプライできないと思いますが。

(無題) 削除/引用 No.291-5 - 2007/10/07 (日) 21:44:39 - 中年 トランスポーターなどの膜を多数回貫通しているような疎水性の高いタンパク質は、SDS-dye存在下でボイルすると凝集してゲルに入らなかったり泳動度がずっと遅れたりすることがあります。ボイルする代わりに37℃で30分程度保温して、それをSDS-PAGEに掛けるようにすると改善されることがあります。 古いフォーラムで何度か類似の話題がありました。「疎水性」などをキーワードに検索してみてください。

(無題) 削除/引用 No.291-4 - 2007/10/07 (日) 16:04:04 - ぱお メッセージありがとうございます。 目的のタンパクは内在性のもので、言ってしまえばpepT1です。 western検出できるレベルで発現しています。 抗体については１次抗体がサンタのもので本当にworkするのか若干不安ではあります。 レーンあたり25ugのタンパク量でアプライしています。 ポジコンはありません。 あと、シグナルは底の方にも見られません。 お二方のご意見ですと抽出は（完全ではないかもしれないが）できていると考えてよろしいのですね。 やはり１次抗体が問題なのでしょうか？他の論文をみても、私が使っているサンタの抗体を使った論文がなく、みなさんペプチド抗体を作製したり、他の方から譲ってもらったものを使用しています。 その辺別のトピックスで質問してみようと思います。

実験系がよくわからないのですが 削除/引用 No.291-3 - 2007/10/06 (土) 14:08:26 - たか 強制発現系でしょうか？内在性でしょうか？分子量は？抗体は確かにworkするものなのでしょうか？caco細胞には蛋白レベルで検出できるくらい発現しているのでしょうか？強制発現なら導入方法に問題はないのでしょうか？発現ベクターはまともに作成できているのでしょうか？ その抽出方法ならいくら膜貫通していてもある程度抽出されると思います。 あと、1レーン辺り何マイクログラムの蛋白をロードされているのでしょうか？ポジコンはないですか？ちょっと考えただけでも疑問点がいくつも挙げられ適格な判断・指示ができません。

(無題) 削除/引用 No.291-2 - 2007/10/06 (土) 11:14:06 - ss ひとつ気になることですが、ウエスタンをしたときにウェルの底とかスタッキングジェル のところとかにシグナルは見えてないでしょうか。超遠心をしなければ、仮に完全に可溶化 されていなくても目的タンパク質は上清にあると思いますので、どこかで検出されていないのかと思いました。

16回膜貫通タンパクの抽出 削除/引用 No.291-1 - 2007/10/05 (金) 15:24:39 - ぱお 現在16回膜貫通型タンパクを抽出し、westernにて発現量を見ようとしています。 抽出にはRIPA buffer (1%NP-40, 1%SDS, 1%sodium deoxycholate, 25mM Tris HCl. 150mM NaCl) を用いています。 細胞はCaco-2細胞で、プレートに接着した細胞にRIPA buffer を添加し、ピペッティングで回収した後、超音波、遠心、上清回収を行い抽出しています。 これで抽出したタンパクをSDS-PAGEに供しwesternにてある膜タンパクの発現を見たいのですがどうもバンドがでません。 抗体濃度などのwesternの条件検討を行ったのですが、どうも目的のタンパクが抽出されていないのではと思います。 このような16回膜貫通型タンパクを抽出するには、どのようにすればよいのでしょうか？ よろしくお願い致します。

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