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ありがとうございます 削除/引用 No.2792-5 - 2009/02/04 (水) 16:25:21 - mimi みなさま、アドバイスありがとうございます。 濃度をふってみるのと、wash条件をきつくしてみることにします。 また、websiteも参考にしてみます。

(無題) 削除/引用 No.2792-4 - 2009/02/04 (水) 10:25:54 - CJ 私は以下のサイトの方法を改変して使っています。 http://www.nibb.ac.jp/brish/ これはかなり「きつい」洗浄プロトコルなはずです。 ところでプローブを変性電気泳動されてますか？これがスメアを引いてると感度が低下するようです。

(無題) 削除/引用 No.2792-3 - 2009/02/04 (水) 06:54:24 - A APさんがおっしゃるようにプローブの濃度を振る以外の方法なら 当たり前ですがwash条件を今よりもきつくするのも一つの手だと 思います。私が共同研究でお世話になった研究室は組織学の 研究室でしたがかなりきついwash条件を使っていると聞いたことが あります。ただプローブが短くハイブリが弱いとポジのシグナルが 弱くなってしまうかも知れないのでその辺りは気をつけてください。 その研究室では300-400merぐらいのRNAプローブを使っていました。

(無題) 削除/引用 No.2792-2 - 2009/02/03 (火) 19:49:44 - AP まず、プローブの濃度を下げてみる。最適な濃度はプローブごとに違うので、いくつかポイントを振ってみる。ターゲットが検出できるなかで、できる限り濃度を下げると、バックが低くS/Nは高くなる。 ハイブリ、非特異的な吸着は（それぞれ係数の違う）プローブ濃度とインキュベーション時間の関数なので、プローブ濃度を一定にしてハイブリ時間を変える（短くする）のも手だけれど、プローブ濃度をできるかぎり下げて、ハイブリ時間を十分にとるほうがきれいにいくと思います。

In situ hybridization プローブの純度 削除/引用 No.2792-1 - 2009/02/03 (火) 19:39:16 - mimi 現在、In situ hybridization用のRNAプローブはfantomの大腸菌を用いてふやし、 colony PCRしたのち、Roche社の「DIG RNA labeling Kit」を使ってRNAプローブの合成を行っています。 切片をもちいて in situ hybridization を行っているのですが、バックがたかくでてしまいます。 ポジコンは特異的にでているため、手法の問題ではなくプローブが原因だと考えているのですが、 プローブの特異性をあげるためには、どのような事を皆様行っていますか？ 適切な長さにアルカリ加水分解で切ること以外に、案があれば、是非教えてください。 よろしくお願い致します。

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