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buy valium 削除/引用 No.2714-24 - 2009/06/04 (木) 04:41:15 - HsvsRsvsesv <a href="<http://groups.google.com/group/buy-best-generic-valium>">buy valium</a>

お礼 削除/引用 No.2714-23 - 2009/01/25 (日) 11:19:46 - とど みなさま　本当に親切なご意見ありがとうございました。 私の質問の仕方が不十分だったために、 みなさまにいろいろな想像、不可解な思いをさせてしまいました。 以後、気をつけます。 少し話がずれたりしましたが、 様々な領域で研究をされている方の考えや知識を 垣間見ることができ、いい機会を得ることができました。 ありがとうございました。 みなさまのますますのご発展をお祈りいたします。

(無題) 削除/引用 No.2714-22 - 2009/01/25 (日) 02:43:28 - おお >[Re:19] とどさんは書きました : > 私は好温菌(生育温度98度)を用いて、 > 基本は酵素学的な基礎実験を行っています。 > なので、まずタンパク質同士を高温下において反応させていました。 なるほどやはりそういうことだったんですね。私はマンマルの細胞 中心に大腸菌や酵母をたまに使う位なので、そう言うのは確かに 最初はぎょぎょっとしてしまいますね。でも考えてみればPCRは そんな低温(37度とか)ではうまく機能しません(いろんな理由は ありますが)。ですので、そういう好熱せいの生物のことにも ファミリアーであるはずなんですけどね。 > 少し勉強しなおしてみます。 こんな感じで、周りの人や先輩などと一度討論してみてください。 修論発表の練習にもなると思います。それで、考えを幾らか まとまったところで府に落ちないことがあれば、ここで 質問してみてもいいかもしれません。ただ、こういうところは 色んなひとが、いろんなことをいいますから、自分で裏をとるか、 参考文献を聞き出すくらいまでした方がいいという面も あります。 >[Re:9] TSさんは書きました : > Binding assayのところの条件が、生理的条件から異常にかけはなれていませんか？80度とか55度で反応っていうのは、なぜ行うのでしょうか？ > 一般的な条件では、室温とか４度くらいで行うものだと思います。 だれを攻めるわけでもないのですが、これを見て自己矛盾を かんじたりします。マンマルであれば37度位が体温を考えると 妥当なわけですが(鳥だと40度くらいですか)、やはりこういう 実験は4度ですることがおおいです。室温という人もいるでしょうけど 37度というのは論文でも見たことがありません。余程酵素反応 (ATPaseなど)が関与しないかぎり、積極的に生体の温度 に近づけませんね。酵素反応もノンスペを防ぐためにわざと30度 でやったりというのもあります。 プロテアーゼなどいろいろ考慮することもあるとは思うのですが 勝手な都合と攻められると、"はいそうです"と堂々と返事して しまいそうです。

(無題) 削除/引用 No.2714-21 - 2009/01/25 (日) 02:39:42 - 免疫屋 最初に僕が変な事を言っちゃったから話が横道にそれちゃったみたいですね． 失礼しました． なるほど細菌を扱っているなら細胞内in vivoという立場でよく理解できます． 最初にも書きましたが，質問者さんが最初からもう少し詳細に記述くだされば生じなかった誤解ということで理解をお願いします．

(無題) 削除/引用 No.2714-20 - 2009/01/24 (土) 22:21:12 - AP >私は好温菌(生育温度98度)を用いて、 >基本は酵素学的な基礎実験を行っています。 ならば、in vivoというのは全く正当ですね。 人はだれでも自分の扱っている材料や、やりかたを中心に考えてしまいがちなので、すれ違いも起こりやすい、、、、、細菌を扱っている人たちにとっては細胞抽出液は細菌からというのがあたりまえでしょうが、真核生物（あるいは動物、ほ乳類、マウス、ヒト？）を扱う研究がグローバルスタンダードであり、それ以外を話題にするときはこれに配慮すべきだとおしつけるのも、学問の世界にそぐいませんしね。

投稿者より 削除/引用 No.2714-19 - 2009/01/24 (土) 14:24:49 - とど さまざまな議論ありがとうございます。 まだまだ自分は無知だなと改めて思いました。 うちのラボで言っているVitroとVivoの使い方が 皆様に違和感を与えてしまったようです。 動物実験中心の方だと固体レベルがVivoなんですよね。 私は好温菌(生育温度98度)を用いて、 基本は酵素学的な基礎実験を行っています。 なので、まずタンパク質同士を高温下において反応させていました。 少し勉強しなおしてみます。

(無題) 削除/引用 No.2714-18 - 2009/01/24 (土) 13:46:35 - おお 実験対象、視点による違いでしょう。 細胞の中で起こっていることを生理的と考えるならin vivoでしょうし、 細胞を使ってても、培養した条件で生理的にかけ離れている 可能性を考えるとin vitroでしょう。 動物実験中心のかたや、酵素を研究しているかたの間で、 表面上ギャップがあることは認識しています。

(無題) 削除/引用 No.2714-17 - 2009/01/24 (土) 13:37:28 - 名無し 私の昔の師匠が培養細胞で（遺伝子入れて）調べてみなさい、というのをin vivoでやってみなさいと言ってました。そこの研究スタイルは、リコンビナント蛋白質を使った試験管内assayでスクリーニング的にバーッとやってあたりをつけて（これをin vitroといってた)、そこでしぼられたものを、じゃあ実際、細胞内ではどうよ、みたいな感じで調べていて、それをin vivoと言ってました。vitroってたしかガラスとかそういう意味ですよね。だから試験管の中での反応ということでin vitro、いちおう細胞膜に包まれたなかで起きている反応（字の通り、生き物の中で起きている反応）ということでin vivoといっているのかなあと思いました。でもその細胞も容器の中で生きてるからやっぱin vitroか？という感じで混乱してきました。私は、それまで動物と細胞を両方同時に同じくらいの割合で使ってやっていたので、はじめは、培養細胞＝in vivo　ハア? みたいな感じになりました。でもそのあともう少し考えたら、たとえば細菌の生化学的研究の場合とかを考えるとたしかにそういう定義のしかたもありかなとも思いました。あとそこは研究所に動物施設がなくて、動物実験はいっさいやっていませんでした（また偉い先生含めて動物で本格的にやったことのある人はほとんどいなくて）。だからin vivoとかin vitroとかの定義は研究分野とか実験に使う生物材料とか、そのひとの研究経験（使ってきた生物種とか研究を進めるスタイル）とかにより影響受ける相対的なもののような気がしています。

(無題) 削除/引用 No.2714-16 - 2009/01/24 (土) 12:53:46 - AP in vivoの用例を、LSDの共起検索でさがしてみしました。 ざっと見ただけのなので、誤読しているかもしれませんが、次の文献などは試験管内無細胞系をin vitro、培養細胞系をin vivoと対比しているようです。 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17442826?dopt=Abstract http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17909000?dopt=Abstract 私はトピ主さんの用法には違和感ありません。一方、それはin vivoではないとみなす立場もわかります。しかし、それを間違いだと断言するほどのことでは、少なくとも現在では、ないと思います。 まして、どなたかがおっしゃっていたようにtransfectionなどによる人為的なタンパク質を分析していることなのかどうかは、トピ主さんの記述からは読めません。むしろ、培養細胞を使ってはいるけれど、全くの内因性のタンパク質複合体を捕まえようとしているように受け取れました。逆に、培養細胞ならなんでもin vitroだという立場の方は、こういう場合でもin vitroというべきだと思われるのでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.2714-14 - 2009/01/24 (土) 12:14:28 - 横から 名無しさん > in vitro to in vivoの定義の違いですが、用いる生物材料によると思います。動植物個体と培養細胞を両方使っているところでは、前者をin vivo,後者をin vitroというようです。主に培養細胞だけ使ってるところだと細胞の実験をin vivo,　チューブ内のモデル実験のようなものをin vitroというみたいです。 教科書的（Wikiなどを見ても）には名無しさんが提示されたような記述が多いのですが、現在でも研究現場に即した定義なのか知りたいところなのです。 教科書的な定義上は名無しさんのおっしゃる通りでも、さすがに培養細胞の検討結果を"in vivo”と表記してある論文はあまり見た記憶がないので。。（あたりまえのようにあったらすいません） また、うちは基本的に細胞中心のラボなんですが、細胞を扱った仕事にin vivoとは記載していないですし、まわりにもいらっしゃらないような。。。 そういう点で、質問者さんのvivoという表現にアレっと思っちゃったわけですけど。 「うち（こういう立場の研究室）では培養細胞の検討結果をin vivoと言っているし論文にもそう書いてるよ！」という事例があると「なるほど！」と思えるかもしれません。また、「昔はうちでも細胞の結果をvivoって書いてたけどいまは書かないね。」という事例なんかも聞けると状況が分かりやすいかな？って思っています。 話が横道にそれちゃいますけど、質問者さんの修士論文の記述にも関係するかも？ということで横からの質問大目に見てください。

(無題) 削除/引用 No.2714-13 - 2009/01/24 (土) 11:51:41 - 名無し in vitro　の系は精製蛋白質を混ぜただけで、つまり自分が必要と思うものだけをを選んでまぜたきわめて特異な人工的環境といえ、そこでは、可能性が示されるということにとどまると思います。遺伝子導入してタグ付蛋白質を発現させてみるような実験も人工的な環境で見ている点では本質的には同似たような問題は最後まで付きまといます。細胞内はいろんな蛋白質その他がさまざまな濃度で存在しています。たとえば調べたい蛋白質が別のある蛋白質と予期しない相互作用していたとしてその相互作用する部分が抗体のエピトープに近くて免疫沈降がうまくいかないでしょう。in vitroの系ならそうした予期しない蛋白質はないのでこうした問題は起こらなかったために分からなかっただけで。その他既に指摘されている問題や、内在性の蛋白質のレベル自体すくないとか、あるいは複合体が何かの条件で一過的にできるもので定常状態ではあまり形成されていない（翻訳後修飾などで調節されていて、特定の条件のもとでしか起こりにくいようにになっている）とか、in vitro　と　in vivoの結果の食い違いの原因はいくらでも考えられるでしょう。 in vitro to in vivoの定義の違いですが、用いる生物材料によると思います。動植物個体と培養細胞を両方使っているところでは、前者をin vivo,後者をin vitroというようです。主に培養細胞だけ使ってるところだと細胞の実験をin vivo,　チューブ内のモデル実験のようなものをin vitroというみたいです。

(無題) 削除/引用 No.2714-12 - 2009/01/24 (土) 06:47:11 - 横から 横からすいません。言葉の使い方で気になりまして。 用語としての"in vivo"の使用法ですが、今でも細胞内反応をin vivoと呼称あるいは表記するのが正式な分野ってまだあるんでしょうか？ 分生などで過去にそういう用法がなされていたとは聞きますし、定義として残っている部分もあるんでしょうが、実験〜論文作成の現場では細胞内をvivoと呼称するのはあまり耳にしないような気がします。 昨今は分野の垣根を超えて研究を実施する形が大半ですし、それに伴って用語の統一も求められていると思うのですが。また、試薬メーカーや機器メーカーもvivoを個体内と考えて表記しているところがほとんどかと思います。 これも含めて印象としては細胞内反応をvivoと呼称することにちょっぴり違和感を覚えてしまうのですが皆さんの分野および現場ではどのように定義されていますでしょうか？ （当方基礎医学系研究室所属です）

(無題) 削除/引用 No.2714-10 - 2009/01/24 (土) 04:40:14 - おお >[Re:1] とどさんは書きました : > タンパク質間の相互作用を調べるために免疫沈降法を利用しています。 > > しかし… > タンパク質間の相互作用は確認できるのに(Vitro)、 > 細胞抽出液を用いると相互作用は確認できません(Vivo)。 > > この場合、生体内では相互作用しないという結論になるのでしょうか。 > どういう解釈にするのが良いのか教えてください。 > 実験に関して、問題点その他指摘されていますので、 細かいことはあまりかきませんが、 その状況で(特に精製たんぱく質を使った実験が、 妥当であるという状況で)、"細胞内での結合について 結論がでていない"ということだと思います。 細胞のライセイトをつかってIPをする時の 問題点、起こりうる可能せいを洗い出して みるとおのずと考察ができると思います。 エピトープ部位がアクセスできるのかとか、、、 精製たんぱく質の実験は非常に温度が高い ようですが、好熱性のいきものでもつかって らっしゃるのでしょうか、、、それとも その方法でフォールディングさせる方法が 確立しているのでしょうか。 マンマルなどの実験ではあんまり考えられない コンディションですので、、、

なんか基本的におかしなところが多そうです。 削除/引用 No.2714-9 - 2009/01/24 (土) 02:17:27 - TS In vitro binding assayをやっているということですが、 >精製タンパク質(4ピコモル)に、等量の目的タンパク質を加え、80℃で5 分間静置。これに反応溶液 (50 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 mM EDTA, 10%グリセロール) を加え、20 µlの系で55℃で20 分間反応。 作製した磁石抗体ビーズを加え、ローターで攪拌 (4℃で一晩)。 0.1%Tween 20を含むPBS溶液500 µlで洗浄、 0.1 Mグリシン pH 3.0 を加え、10 分間静置。 遠心後の上清をSDS-PAGEして、ウェスタンって手順です。 Binding assayのところの条件が、生理的条件から異常にかけはなれていませんか？80度とか55度で反応っていうのは、なぜ行うのでしょうか？ 一般的な条件では、室温とか４度くらいで行うものだと思います。 この条件を見せられると、この条件だからBindingが見れたんじゃないの？って指摘される可能性がありそうですが。 少し気になったんですが、Glyで溶出ですか？　なぜLaemmli's Sample bufferを使用しないのですか？　 Co-IPの系もちゃんと動いてるのかどうか確認されているのでしょうか？ つまり、自分のところで実績のあるCo-IPの方法なのでしょうか？ それにBiacoreなんて、いま気にすることではないでしょう。 いろいろ乱雑に書いてしまいましたが、少し見直すところが多い気がします。

(無題) 削除/引用 No.2714-8 - 2009/01/24 (土) 01:23:10 - とど りんさん　書き込みありがとうございます。 > 確認ですがコントロールはおいてますよね？ コントロールとしては反応させていない細胞抽出液を SDS-PAGEで一緒に流してます。 このバンドはちゃんと見えてるんです。 > 具体的なバッファー組成などを書かれてみてはいかがでしょうか？ > elutionではなくて反応にグリシンを使用されているのでしょうか？ 精製タンパク質(4ピコモル)に、等量の目的タンパク質を加え、80℃で5 分間静置。 これに反応溶液 (50 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 mM EDTA, 10%グリセロール) を加え、 20 µlの系で55℃で20 分間反応。 作製した磁石抗体ビーズを加え、ローターで攪拌 (4℃で一晩)。 0.1%Tween 20を含むPBS溶液500 µlで洗浄、 0.1 Mグリシン pH 3.0 を加え、10 分間静置。 遠心後の上清をSDS-PAGEして、ウェスタンって手順です。

(無題) 削除/引用 No.2714-7 - 2009/01/24 (土) 01:07:31 - りん >[Re:6] とどさんは書きました : > 精製タンパク質を用いて免疫沈降し（Vitro）、相互作用したもの > (アーティファクトかもしれないけどウェスタンでバンドが見えたもの) > Vivoで確かめています。 確認ですがコントロールはおいてますよね？ > 免疫沈降自体の条件検討は行っておらず、 > 生物の生体内と同じpH、塩濃度で反応させています。 具体的なバッファー組成などを書かれてみてはいかがでしょうか？ これでは他の方もアドバイスしにくいと思います。 > （免沈にはグリシンを使ってます。） elutionではなくて反応にグリシンを使用されているのでしょうか？

投稿者です 削除/引用 No.2714-6 - 2009/01/24 (土) 00:25:09 - とど 記載が甘くて申し訳ありませんでした。 In vitroというのは精製タンパク質を用いていて、 In vivoというのは細胞抽出液を用いているものです。 「in vitroで合成したタンパク質同士では結合するのに 培養細胞をlysisしてIPしたら共沈してこなかったということ」です。 まずTwoHyで相互作用が見られたものを、 精製タンパク質を用いて免疫沈降し（Vitro）、相互作用したもの (アーティファクトかもしれないけどウェスタンでバンドが見えたもの)を、 Vivoで確かめています。 なのでBIACOREなどではまだ調べていません。 免疫沈降自体の条件検討は行っておらず、 生物の生体内と同じpH、塩濃度で反応させています。 （免沈にはグリシンを使ってます。） 再度アドバイスいただけたら幸いです。

なんとも言えませんが… 削除/引用 No.2714-5 - 2009/01/23 (金) 20:29:24 - りん 学生さんと想像して答えます。 in vitroで合成したタンパク質同士では結合するのに培養細胞をlysisしてIPしたら共沈してこなかったということでしょうか？ 質問者様がどのような条件で実験をされて、どの程度条件検討されたかわかりかねますので何とも言えません。 細胞の溶解に用いたbufferはそのタンパク質のco-IPに適切ですか？ ディタージェントは何を使用していますか？塩濃度は適当ですか？ たとえば、SDSやDOCなどはかなり強力な界面活性剤なので、これらを用いるとco-IPされないことも多々あります。 co-IPは条件により検出されないこともよくあることだと思います。 また、もし相互作用しないと思われるな他の方法でも確認されてみてはいかがでしょうか？ IFAなどで共局在しているかどうかなどや、M2Hによる実験も指標の一つになると思います。 相互作用しないことの証明は大変気を使います。もし質問者様が、1つの実験の１つの条件しか試されていないなら、条件を振ったり複数の異なる実験手法用いたりされることをお勧めします。

(無題) 削除/引用 No.2714-4 - 2009/01/23 (金) 20:23:27 - 免疫屋 VitroとVivo，生体内といった用語が一般的な用法からは離れた形で使用されているのでイマイチ概要が掴めません． また免疫沈降法をタンパク質間の相互作用検出に利用しているとありますが，これはここで言うVitroとVivoの両方で利用しているということなのか，Vivo（と言っている条件）でのみ利用しているものなのかも判断に困ります． まず確認ですが，VitroというのはBiacoreなどを使用して相互作用を確認したということでしょうか？　それとも培養細胞を用いて免疫沈降を実施したということでしょうか？ Vivoというのは，培養細胞抽出液のことを言っているのか，生体内よりフレッシュに分離した細胞の抽出液のことを言っているのか云々． まずはどういう条件とどういう条件での比較についてなのか皆さんがわかるように記載ください．

(無題) 削除/引用 No.2714-2 - 2009/01/23 (金) 20:10:10 - だい >[Re:1] とどさんは書きました : > タンパク質間の相互作用を調べるために免疫沈降法を利用しています。 > > しかし… > タンパク質間の相互作用は確認できるのに(Vitro)、 > 細胞抽出液を用いると相互作用は確認できません(Vivo)。 Vitroの免疫沈降の実験での相互作用をさせている反応液の組成や温度、pH等の条件が、Vivoの細胞抽出液が含まれる用いている条件とほぼ同じだとすると、 �@もともとVitroの反応がアーチファクトだっただけで、生体内では反応しない �A抽出液中の目的のタンパク質の発現量がもともと少ない、もしくは上手く溶解できていない、または溶解して直ぐに抽出液中のプロテアーゼにより分解された等の理由により、結合したタンパク量が少なくなってしまい検出されない �B抽出液中の別のタンパク質によって結合が阻害されている �C抗体が劣化した くらい、思いつきました。 私も同じ修論生です。がんばりましょう。

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