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(無題) 削除/引用 No.2695-17 - 2009/01/22 (木) 13:47:36 - EnBi ＞ご意見ご指摘いただいた皆様 もういちど手技を一から見直してみようと思います。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.2695-16 - 2009/01/21 (水) 23:54:11 - おお 知らない間にいっぱいフォローいただいてます。 っっと今さら現れてみる。

(無題) 削除/引用 No.2695-15 - 2009/01/21 (水) 20:01:44 - AP >それにしてもGEヘルスケアのHPの主張は不可解ですね。誤訳じゃないんでしょうか。 誤訳ではないようです。 http://www5.gelifesciences.com/aptrix/upp00919.nsf/content/60D8F658BEB8EFF9C12572350030ADE7?OpenDocument&entry=5&LinkParent=C1256FC4003AED40-3DAF1A5ADED60E5AC125701900490A0E_RelatedLinksNew-58A8CEABE58E182B852573CC00571B30&newrel&hidesearchbox=yes&ModuleId=38859&Hometitle=Catalog 問題が生じることがあるのでrecA mutantでcloningやmaitenanceはしない方がいいというのは、 実際にそういう例がたびたび報告されたからということでしょう。 その一方、 The poor transformability of BL21 necessitates the need for the different strain for cloning and maintenance. とありますから、クローニングの段階ではBL21より形質転換効率のよい株を使うべきということも書いてありますね。 JM103のようなrecA+が理想的なんでしょうが、実際にはrecA mutantを使っている人もたくさんいると思います。 とにかく、クローニングの段階ではrecAのアリルにかかわらず形質転換効率の高い株を使った方がいいでしょう。

(無題) 削除/引用 No.2695-14 - 2009/01/21 (水) 19:34:25 - coli 以前GEに問い合わせたときは、確かにRecAホストですが、形質転換効率の悪さからクローニング段階でのBL21の使用はお勧めしないとの回答を頂きました。 気になったのが、プレートや液体培地にグルコースを入れて、プロモーターのリプレッションを効かせていますでしょうか？ 転写産物が何か悪さしているとしたら、変異が起こったプラスミドを持つものが選択的に増えてくることもありうるかと思いましたので。

(無題) 削除/引用 No.2695-13 - 2009/01/21 (水) 19:11:38 - 中年 私もJM109でまず求めるプラスミドを構築し、正しい構造を持っていることをが確認されたクローンをBL21に再形質転換することをお勧めします。 それにしてもGEヘルスケアのHPの主張は不可解ですね。誤訳じゃないんでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.2695-12 - 2009/01/21 (水) 19:01:01 - AP ひと月ほど前に別HNのかたが同様の質問をされていますが、 http://www.kenkyuu.net/cgi-biotech2/biotechforum.cgi?mode=view;Code=2484 同じかたですか？　いや、もし別人であれば、このベクター固有の問題で頻発しているのかと、、、 とりあえず、偶発的な変異であれば同じことが別の機会に起こらないはずなので、ベクター調製、インサート調製を含め、一からやり直してみるしかなさそうですね（それとももう何度かやっているんでしょうか）。いずれにしろ、今あるコンストラクトが使えないことは確かですから。

(無題) 削除/引用 No.2695-11 - 2009/01/21 (水) 18:49:52 - EcoRI JM109もクローニングに頻用される株ですね 可能だと思います。 ligation -> competentなJM109に導入-> plasmidを調製(alkaline-SDSで十分) ->一応シーケンスを確認->BL21に導入 というステップを踏めば、トラブルシューティングも簡単です。

(無題) 削除/引用 No.2695-10 - 2009/01/21 (水) 18:40:59 - EnBi > EcoRIさん > ライゲーションで作ったコンストラクトを直接BL21などのタンパク質発現用の菌株に導入することは避けた方がいい、 > ライゲーション後のコンストラクトは、DH5aなどのクローニング用の株に入れて、完全にcircularなものをBL21に導入した方が、安心できる > ということです。 そうでしたか〜。うちにはJM109しかないんですが、DH5aの方がいいのでしょうか？ 研究室に何のノウハウも無く、誰も組換えの知識が無いので困っています。

(無題) 削除/引用 No.2695-9 - 2009/01/21 (水) 18:20:31 - EcoRI おおさんの仰ったことは、 ライゲーションで作ったコンストラクトを直接BL21などのタンパク質発現用の菌株に導入することは避けた方がいい、 ライゲーション後のコンストラクトは、DH5aなどのクローニング用の株に入れて、 完全にcircularなものをBL21に導入した方が、安心できる ということです。 私もそう思うのですが…どうもGEとは意見が異なるようです。 コンストラクトの作製・維持はrecA変異株で、 タンパク質発現はプロテアーゼ欠損株で と研究を始める際に教えてもらったので、それを信じてるのですが… それから、 下記トピックの3538-25から上の(より新しい)回答がとても参考になると思います http://www.kenkyuu.net/cgi-biotech/biotechforum.cgi?mode=view;Code=3538

(無題) 削除/引用 No.2695-8 - 2009/01/21 (水) 18:18:05 - EnBi >~さん > 貴方は一度もベクターにインサートが入っていることを確認していませんよね。普通に考えると、この結果はインサートが入っていないセルフライゲーションしたベクターを拾っていると受け止められます。 > なぜ、この操作でインサートが入っていると判断したのですか？ コロニーから増やしたものを制限酵素で再切断してインサートが入っていることは確認しています。

(無題) 削除/引用 No.2695-7 - 2009/01/21 (水) 18:07:43 - ~ >ライゲーションして形質転換した後に、培養した菌からインサートの入ったベクターを回収して制限酵素処理するとベクターの長さが1 kb程度短くなっています。 貴方は一度もベクターにインサートが入っていることを確認していませんよね。普通に考えると、この結果はインサートが入っていないセルフライゲーションしたベクターを拾っていると受け止められます。 なぜ、この操作でインサートが入っていると判断したのですか？ >ただベクターを切って、貼って、切っただけなのに長さが変わる意味がわかりません。 本当に"貼れているのか"について、どのような確認をしていますか？ >ライゲーション前までは問題ないことを確認しているので ライゲーション自体の確認が出来ていませんよね。 そこを疑うのが第1歩でしょう。

(無題) 削除/引用 No.2695-6 - 2009/01/21 (水) 17:46:51 - EnBi ＞APさん > 形質転換してコロニーを生やしたときリコンビナントはたくさんでましたか。 コロニー数は正確に数えてないですが、数十個程度は出ていた思います。 > 複数取れたなら、その欠失パターンは一致していましたか？ インサートが入っている、いないにかかわらず同じ現象が見られました。 ベクターはpGEX-6p-3を使って制限酵素はBamHI、EcoRIで切ってます。あと制限酵素処理後に脱リン酸化もしてます。 ＞おおさん > インサートを切り出した方のプラスミドを拾っているということは > ありませんか? インサートを切り出したほうのプラスミドとはどういうことでしょうか？理解力不足ですみません。 > あとBL21にライゲーションプロダクトを直接導入しない方がいいです。 GEヘルスケアのHPに以下のように書いてあったためにしたのですが・・・ pGEX Vectorには発現を調節するlac Iqリプレッサーがあるため、基本的には市販されている多くの大腸菌を使用することができます。しかしながらrecA1対立遺伝子をもつ大腸菌株を用いた場合にプラスミドDNAの転位や欠失を引き起こす可能性が報告されていますので、recA1対立遺伝子をもたない菌株を用いることをおすすめします。 recA1対立遺伝子をもたない菌株：BL21、TG1、JM103、JM105など recA1対立遺伝子をもつ菌株：DH5α、XL-1 Blue、JM109など > 拾ったクローンすべてそのような状態なら、 > 慎重にサブクローニングの手技を見直すことも > 必要かもしれません。 拾ったクローンは全て短くなっています･･･。 やはり、手技なのでしょうか。ライゲーション前までは問題ないことを確認しているのでよくわからなくなっています。

(無題) 削除/引用 No.2695-5 - 2009/01/21 (水) 16:57:49 - AP 形質転換してコロニーを生やしたときリコンビナントはたくさんでましたか。 すごく少なくて、ようやく取れたという場合だと、導入した遺伝子からのleakyに発現するタンパク質が毒性のため、発現しないような変異を起こしたものが選択的に取れてきたのかもしれません。 複数取れたなら、その欠失パターンは一致していましたか？ ベクターのバージョンや使った制限酵素サイトなど、もうちょい詳しいストラテジーの情報があるとなにか予想できるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.2695-4 - 2009/01/21 (水) 16:52:52 - おお 間違ったクローンを拾ってきてます。 インサートを切り出した方のプラスミドを拾っているということは ありませんか? あとBL21にライゲーションプロダクトを直接導入しない方がいいです。 拾ったクローンすべてそのような状態なら、 慎重にサブクローニングの手技を見直すことも 必要かもしれません。

(無題) 削除/引用 No.2695-3 - 2009/01/21 (水) 16:48:20 - EnBi ヒートショックで導入した後のプラスミドを制限酵素処理するとインサートの長さは変わらず、ベクターの塩基鎖長が短くなっています。 ただベクターを切って、貼って、切っただけなのに長さが変わる意味がわかりません。 なので、そんな意味不明な現象の起こらないような形質転換の仕方が知りたいと言う方が正しかったと思います。すみません。

(無題) 削除/引用 No.2695-2 - 2009/01/21 (水) 16:32:58 - アルツハイマー伯爵 えーと、仰ってることが今ひとつよく分からないのですが、明らかに長さがおかしいプラスミドを用いて組換えタンパク質の発現を試みておられると、そういうことでしょうか。 でしたら、発現しなくて当たり前としか言いようがありません。

プラスミドの変異？ 削除/引用 No.2695-1 - 2009/01/21 (水) 16:07:47 - EnBi pGEX系のプラスミドを使ってタンパク質の発現を目指しているのですが、タンパク質が誘導されている気配が全くありません。菌種はBL21で、IPTG添加(終濃度1mM)、37℃で4時間の条件で誘導しています。 補足ですが、ライゲーションして形質転換した後に、培養した菌からインサートの入ったベクターを回収して制限酵素処理するとベクターの長さが1 kb程度短くなっています。JM109に導入したときも同様の現象が起きていました。これがタンパク質の発現に何か問題を引き起こしているのでしょうか。それともやはり、誘導条件の問題でしょうか。あと、シーケンシングはまだしておりません。 どうか、ご教授お願いします。

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