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覚え書き程度に 削除/引用 No.2681-22 - 2009/03/06 (金) 15:27:16 - たれてん 発現すればいいや、くらいの純度でいいのなら、 Sol1（RNase入り）→２（よく混ぜます）→３（しっかり混ぜて中和します）→遠心→supをイソプロ沈→７０％エタで洗って→ＴＥ これで、すぐにトランスフェクションやシークエンシングに持って行くのであれば、ほとんど問題ありません。Bacmidをミニプレップしてバキュロウイルスを得るくらいの作業でも十分使えます。フェノールを使わなくて良いので、排出コストも安い。 この方法で問題なのは、賞味期限が短い、ということです。 だいたい普通の冷蔵庫で数ヶ月、フリーザーで１年くらいがなんとか使える限度です。 プレパレーションによっては、再度大腸菌に形質転換することさえ不能な場合もあります。 ボイリング法も賞味期限は同じく短い。 スクリーニングには、お手軽な方法で良いと思います。しかし、大事なコンストラクトやバックボーンとして使用頻度の高いプラスミドなどは、キットやCsClで精製をするのが良いでしょう。 CsClで精製するのは、手間がかかりますが、実際に目で見えて安心できるので、私は結構好きです。

(無題) 削除/引用 No.2681-21 - 2009/02/14 (土) 00:06:55 - genji キアゲンのマシーンを使って自動で抽出しております。。。

(無題) 削除/引用 No.2681-20 - 2009/02/12 (木) 10:02:56 - たいあ http://www.genedesign.co.jp/products/others/others.html プロメガの余ったバッファで使っていますが、 いまのところ問題なしです。

(無題) 削除/引用 No.2681-19 - 2009/02/11 (水) 08:20:35 - ねむ QIAGENはありますよね。 >[Re:18] micoさんは書きました : > 横から申し訳ないんです。いろんなﾌﾟﾗｽﾐﾄﾞ精製用のカラムKITがありますが、 > KITを使用しても大量にバッファー類が余ってしまうのが大きな大きな悩みです。 > カラムだけ売ってくれるKitってご存知ありませんか？

(無題) 削除/引用 No.2681-18 - 2009/02/10 (火) 23:00:04 - mico 横から申し訳ないんです。いろんなﾌﾟﾗｽﾐﾄﾞ精製用のカラムKITがありますが、 KITを使用しても大量にバッファー類が余ってしまうのが大きな大きな悩みです。 カラムだけ売ってくれるKitってご存知ありませんか？

(無題) 削除/引用 No.2681-17 - 2009/02/10 (火) 19:41:53 - motoo ヨコレスで、失礼致します。 VIOGENEの精製キットを使っております。 たまに落下速度が大変遅いカラムがあり、少なからず困っています。 落下速度を正確に計っていませんが、最終的に通常のカラムより５倍以上かかることもあります。 同じコンストラクトのものでも、カラムによってかなり差が生じる場合もあります。 メーカーさんにも、問い合わせてはみたのですが… 原因や改善策が少し曖昧です。 お心当たりの方、ご意見頂けると幸いです。

(無題) 削除/引用 No.2681-16 - 2009/02/09 (月) 15:43:31 - nn キアゲンの精製キットを使っていましたが キアゲンより価格が安いということで、最近VIOGENEのキットに変更しました。 キアゲンと同じようにカラムに通しての精製で、 品質には問題ありませんでした。

(無題) 削除/引用 No.2681-15 - 2009/01/23 (金) 00:49:48 - taka APさん プロトコルを教えて頂いて、ありがとうございました。 実際に試してお礼を兼ねて報告しようと思ってたのですが、 諸事情でシークエンスが延期になってしまいました・・・残念です。

(無題) 削除/引用 No.2681-14 - 2009/01/21 (水) 13:37:26 - 中年 AP様、 ありがとうございます。RNAがどかっと入っていてもシークエンスには問題ないんですね。 その昔、KlenowやT7 polymeraseなどでシークエンスをしていた頃は（歳がバレますね）、鋳型プラスミドはアルカリSDS法（フェノール処理無し）の精製度で十分だけど、切れ残りのRNAだけはベタベタ付いてプライマーとして働いてしまうので、それを殺すためにRNaseAを通常の10倍濃度で入れるというトリックがありました。今はシークエンス反応を高温でやるので、complexityの高い核酸のコンタミはさほど問題にならないということなんでしょうね。

(無題) 削除/引用 No.2681-13 - 2009/01/21 (水) 13:20:50 - AP >クラボウさんのミニプレマシーンのプロトコルは、最後に溶解するTEにRNaseAが入ってませんでしたっけ？ 最近使っていないので、今は変わっているのかもしれませんが、デフォルトはTEです。ユーザーがそうしたければ、溶解液のボトルにRNaseを加えてもよいと言う程度です。

(無題) 削除/引用 No.2681-12 - 2009/01/21 (水) 12:55:06 - 中年 クラボウさんのミニプレマシーンのプロトコルは、最後に溶解するTEにRNaseAが入ってませんでしたっけ？

(無題) 削除/引用 No.2681-11 - 2009/01/21 (水) 11:59:52 - AP >あるメーカーの自動プラスミド抽出システム ネタばらしをすると >クラボウがプラスミド精製まシーンを出しています。 それです、、、

(無題) 削除/引用 No.2681-10 - 2009/01/21 (水) 11:33:49 - おお 横レスに、横回答ですが、、、 クラボウがプラスミド精製まシーンを出しています。 その機械は基本的にSol1、2、3、エタチンかイソプロチンです。 溶液のどれかにフェーノールが入っていて(溶液に解けるぐらい 微量に)、若干の改良点があります。 この精製装置で得られるプラスミドはそのままシーケンスに 持っていってもきれいに読めてました。 キットでメリットがあるものはまだいいんですけど プラスミド精製きっとはシリカつかって、アルカリ法 よりきれいになったりしますし、、、、 RTPCRようのキットなんか何のへんてつもない、バラで売られている dNTPとか酵素とそのバッファーとランダムオリゴマーとオリゴdTとか 組み合わせて売っているだけで、、バラで買うより高いんだろうな、、 とおもうような呆れたものもある様におもえます。 だから何でしょうか、どうも一つ一つ実験を考えて組むというのが できる人が少なくなってきているような不安にかられます。 キットのようにまぜて、あなたの行っている最先端の実験が できるのですか! とふぉんと80ぐらいの大きさで書きたい。 暴走してます。。。。。。。。。。。

(無題) 削除/引用 No.2681-9 - 2009/01/21 (水) 11:17:50 - AP >Sol1,2,3を加えて遠心、イソプロ沈（エタ沈？）してRNase入りTEに溶解という感じでしょうか？ そうですね。tipsとしては、Sol.IIIは通常のKOAc bufferでもいいんですが、7.5 M NH4OAcにしています。 http://www.kenkyuu.net/cgi-biotech2/biotechforum.cgi?start=1;mode=view;Code=1256 念のため（ほかの精製方法でもやりますが）DNaseの残留があっても失活するように、溶解を65-70度、15分程度、加温して行っています。 >シークエンス用のサンプルだともう少しキレイにした方がいいのかな。と思ってました。 少なくとも日常行うレベルの、特に難しい問題のないシークエンスならカラム精製のプラスミドと遜色ありません。 以下余談、 ABIシークエンスキットのインストラクションではプラスミド精製に関してかなり高度な要求をしていますが、変なことされて「シークエンスがうまくいかなかったじゃないか」と文句を言われないよう、免責のために最上級の警告をしているんじゃないかと思います。 以前、あるメーカーの自動プラスミド抽出システムのデモを見せてもらったとき、RNase処理のステップがなく、RNAがそのまま残っているような仕上がりで、さすがにRNase処理やPEG沈しないとシークエンスには使えないんじゃないかと問いつめました。 すると、「ABIさんの手前、弊社の公式見解として、そのままシークエンスに使えますと推奨することも保証することもできませんが、実際にそうやっているユーザーさんもいらっしゃって、特に問題ないとおっしゃっています」とのことでした。私もはじめは半信半疑だったのですが、やってみると実際そうだったわけで。

(無題) 削除/引用 No.2681-8 - 2009/01/21 (水) 01:28:08 - taka 横からすみません。 APさん、アルカリSDS法について具体的に教えてください。 Sol1,2,3を加えて遠心、イソプロ沈（エタ沈？）してRNase入りTEに溶解という感じでしょうか？ 普段、インサートチェックはそれくらいなのですが、シークエンス用のサンプルだともう少しキレイにした方がいいのかな。と思ってました。 それにしても、何でもキットですね。 僕は貧乏性なのでもったいないなー。とついつい思っちゃいます。

(無題) 削除/引用 No.2681-7 - 2009/01/21 (水) 00:29:28 - AP 普段使用するプラスミドは、アルカリ/SDS法（フェノール抽出なし）で精製しています。シークエンスや切り貼り操作などほとんどの実験目的では、これで十分です。目的に応じてフェノール抽出を加えたり、エンドトキシンを除かなければならないときはキアゲンを使います。 エンドトキシンを除く目的でCsCl密度勾配を使っていたこともありますが、最近ではキアゲンで間に合わせています。CsCl法のほうが、ゲノムDNAやその他諸々の不純物が完全に取り除けるので、たとえばマイクロインジェクションで使うときに粘性が低く詰まりにくかったりしていいのですが、労力を考えてキアゲンで妥協しています。 スクリーニングの段階では、数によってはボイル法を今でも使います（コロニーPCR懐疑派なので）。 最近は、どんな目的であれ（たとえばコロニースクリーニングの段階ですら）いきなりキアゲンを使って精製する人も見受けられるのですが、オーバースペックでコストがもったいないし、数もこなせないのでどうかと思っています。お金のあるラボだと、学生指導をするよりキットと説明書をわたして、この通りやれというほうがはるかに楽なんでしょうが、キットなしではなにもできない研究者の卵たちを見ると少々先行き不安です。

(無題) 削除/引用 No.2681-6 - 2009/01/20 (火) 23:08:23 - natu ボイル法とかやってる人はいないんすかねー？

(無題) 削除/引用 No.2681-5 - 2009/01/20 (火) 17:20:40 - あべちゃん ヨコスレ、失礼します。 > とおもったりします。ちなみにLPSを除くためにやっているのは > デタージェンを加えて(TRITON-100とか)カラムにかける > という工夫だけでした。今はよく分かりませんが(使って triton x-114じゃなかったですか？ それとも100でも、LPS除去できるんですか？ 後学のため、確認させて下さい。

(無題) 削除/引用 No.2681-4 - 2009/01/20 (火) 16:56:53 - おお キアーゲンのからむはDEAEなので、FPLCでできるんじゃないの とおもったりします。ちなみにLPSを除くためにやっているのは デタージェンを加えて(TRITON-100とか)カラムにかける という工夫だけでした。今はよく分かりませんが(使って ないので)もう少し、進化しているかもしれません。 超遠心は昔使ってました。

(無題) 削除/引用 No.2681-3 - 2009/01/20 (火) 16:43:59 - MP CsCl超遠心は手間を考えると、よほどのことがない限り使っていません。 ただES細胞のtransfectionの際はCsCl精製したものを使いました。キアゲンだとトラブルが起こる可能性があるらしいです。 それからカラムは会社によってはLPSが大量にコンタミしてくることがありますので注意が必要です。 ちなみにキアゲンは普通のグレードでも大丈夫です。

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