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細胞を剥離させる際のEDTA濃度の限界について トピック削除
No.2633-TOPIC - 2009/01/13 (火) 11:08:40 - 理学部４年
お世話になります。
どうかみなさまの経験豊富なお知恵をお貸しいただけませんでしょうか。

今後、接着細胞を薬剤処理後の膜タンパクの発現変化をFACSを用いて定量していきたいと考えております。このタンパクはtrypsin sensitiveなため、EDTAで細胞を回収しなければなりません。

以前この細胞をEDTA/PBSで剥がそうとしていた時に、濃度を誤って0.5 Mという高濃度で処理してしまいました。

その際には細胞は3分程度で完全にはがれ、その後、FACSをしたところ目的のタンパクは理想通り検出できました。この時、細胞は死んでおりませんでした。

通常、細胞を剥がす際に5-10 mM程度で剥がすとは思います。

みなさんははがれにくい細胞をどの程度までEDTA濃度を上げられますでしょうか？
あるいは時間はどの程度まで処理することが許されますでしょうか？
そして、室温での処理と３７℃での処理とではどちらがはがれやすいでしょうか？

どうか教えてください、お願いいたします。
　
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(無題) 削除/引用
No.2633-11 - 2009/01/16 (金) 15:47:58 - ~
あれ？
マトリゲルって冷やすと再度液化しませんでしたっけ？
別のものと混同していたみたいです。

冷やして剥がして数回継代をしたので、少なくともマトリゲル+セルリカバーソリューションではないですね。
液体でサンプルを貰って、塗ったので、Upcell,Repcellでもないようです。

どこかの開発品で、市販されなかったものだったのかもしれません。
失礼しました。

(無題) 削除/引用
No.2633-10 - 2009/01/16 (金) 12:58:55 - おお
>[Re:9] #さんは書きました :
> 和光あたりが取り扱っているRepcellのことでしょうか？
> ディッシュ表面のポリマーの性質が温度依存的に変化するようです。


>[Re:8] mom-aさんは書きました :
> おおさんがおっしゃっていられるのはUpcellのことかな？と思ったのですが、これだと細胞同士はバラバラにならないので、FACSには難しいかもしれませんね。
> http://www.cellseed.com/product/004.html

http://www.cellseed.com/product/002.html
Repcellでした。EDTA存在下でけんだく、ピペッティングで何とか一つ一つの細胞にほぐせないかと思ったのですが、、、
あと薄くまいて、そんなに密度が高くない時に回収して差し支えなければより取りやすいかもと思いました。
Upcellとかいろいろシリーズが今出てるんですね。

(無題) 削除/引用
No.2633-9 - 2009/01/16 (金) 12:48:54 - #
和光あたりが取り扱っているRepcellのことでしょうか？
ディッシュ表面のポリマーの性質が温度依存的に変化するようです。

(無題) 削除/引用
No.2633-8 - 2009/01/16 (金) 12:48:43 - mom-a
おおさんがおっしゃっていられるのはUpcellのことかな？と思ったのですが、これだと細胞同士はバラバラにならないので、FACSには難しいかもしれませんね。
http://www.cellseed.com/product/004.html

~ さんがおっしゃっているのは、マトリゲルからセルリカバリーソリューションで細胞を回収する方法でしょうか？私はマトリゲルからはディスパーゼで回収した経験しかないのですが、こんなのもあったのですね…。http://www.bdj.co.jp/falcon/products/1f3pro00000sgin4.html#block_top3

(無題) 削除/引用
No.2633-7 - 2009/01/16 (金) 09:46:51 - ~
>冷やすとコートしているゲルの物性が代わり、細胞が剥がれてくる
BD社のマトリゲルですね。

試しては見ましたが、細胞への影響が何ともいえませんので、
使える場面を探すのが難しいです。

(無題) 削除/引用
No.2633-6 - 2009/01/16 (金) 06:15:27 - おお
こんな方法もあります。37度では普通のカルチャー用のディシュなのですが、
冷やすとコートしているゲルの物性が代わり、細胞が剥がれてくるという
ものが商品化されています。
名前思い出せないのですが、余裕がある時に調べておきます。

(無題) 削除/引用
No.2633-5 - 2009/01/16 (金) 01:50:50 - の
EDTA以外に剥離するのであれば、
細胞間同士は結合したままですが、
ピペッティングではなく、
5mMのEDTAを37度で最小限の時間で静置した後
スクレイパーで剥離してみてはいかがでしょうか。

(無題) 削除/引用
No.2633-4 - 2009/01/14 (水) 09:34:26 - 名無し
EDTAは、そのはたらきを考えると、細胞間の接着を弱めるのはよく分かるのですが、細胞とディシュの間の接着はどのような仕組みで剥がすのでしょうか。インテグリンなどの受容体とビトロネクチンやファイブロネクチンのような蛋白質の間の結合にも金属イオンが関与しているのでしょうか。

(無題) 削除/引用
No.2633-3 - 2009/01/13 (火) 22:05:31 - culture
無茶な濃度ですが、確かにそれくらいでも大抵の細胞は生き残るようです。
浸透圧が変化するので小さくなりますが、可逆的ですから。
ただ生き残らない細胞集団もあるかもしれないし、形質が変わる可能性もあるので、継代ではやめた方がよいです。
もっとも、トリプシンEDTAでもそういう集団を失っている可能性は否定できないのですけど。
私も10mM EDTAをPBSの中に入れて３７度で剥がす方法をどこかで見た気がします。
この程度だと、短時間なら問題なさそうな気はします。
加温するかどうかは、細胞によるでしょう。

(無題) 削除/引用
No.2633-2 - 2009/01/13 (火) 21:32:54 - おお
1mM以上は使ったことがありません。0.5Mは異常だと思います。
塩濃度その他でほかの影響も出てくると思います。
5mMとか使うかもしれませんが、はがれないならほかの方法を
考えた方がいいとおもいます。
温度はたしかに高い方がはやいでしょう。

細胞を剥離させる際のEDTA濃度の限界について 削除/引用
No.2633-1 - 2009/01/13 (火) 11:08:40 - 理学部４年
お世話になります。
どうかみなさまの経験豊富なお知恵をお貸しいただけませんでしょうか。

今後、接着細胞を薬剤処理後の膜タンパクの発現変化をFACSを用いて定量していきたいと考えております。このタンパクはtrypsin sensitiveなため、EDTAで細胞を回収しなければなりません。

以前この細胞をEDTA/PBSで剥がそうとしていた時に、濃度を誤って0.5 Mという高濃度で処理してしまいました。

その際には細胞は3分程度で完全にはがれ、その後、FACSをしたところ目的のタンパクは理想通り検出できました。この時、細胞は死んでおりませんでした。

通常、細胞を剥がす際に5-10 mM程度で剥がすとは思います。

みなさんははがれにくい細胞をどの程度までEDTA濃度を上げられますでしょうか？
あるいは時間はどの程度まで処理することが許されますでしょうか？
そして、室温での処理と３７℃での処理とではどちらがはがれやすいでしょうか？

どうか教えてください、お願いいたします。
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