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QuikChangeでPCR後もサンプルの増幅が見られません トピック削除
No.2619-TOPIC - 2009/01/09 (金) 15:21:37 - mm
QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kitを使って変異の導入を試みていますが、PCRの時点でコントロールと比較してほとんど増幅が認められません。
transformまでとりあえずやってみるものの、やはり何度やってもコロニーは認められず、プライマーの問題かと考え、場所や長さを変えて設計しなおしてみたのですがやはり増幅されません。

元々のベクターはpGL4で、それにかなりGC richな領域を2kb入れて作成したものでした。

この前のベクター作成の段階でも、GC richであったためか、様々な酵素でうまくPCRがかからず大変苦労したいきさつもあります。

今後どのような工夫をすればうまくいく可能性があるでしょうか？

よろしくおねがいします。
　
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かいけつしました！ 解決済み 削除/引用
No.2619-5 - 2009/02/20 (金) 16:48:05 - mm
酵素をKOD FXに、PCRサイクルを２５サイクルまで増やしたところコロニーができました。
１２サイクル、１８サイクルではダメでした。
どうもありがとうございました！！

(無題) 削除/引用
No.2619-4 - 2009/01/10 (土) 15:28:48 - ザンギ
>PCRの時点でコントロールと比較してほとんど増幅が認められません。

PCRがかかりにくさが原因でしょうから、酵素を別のものにしたりベタイン使ったりして、とにかくPCRがかかるように最適化するのがいいんではないでしょうか。

http://www.iam.u-tokyo.ac.jp/bnsikato/protocol/b10.html

(無題) 削除/引用
No.2619-3 - 2009/01/10 (土) 12:02:34 - EcoRI
GCリッチならDMSOとかベタインとか入れてみる
というのも…

(無題) 削除/引用
No.2619-2 - 2009/01/10 (土) 11:20:59 - j
私はそのkitを使用したことはないですが、以前にまったく同じ質問があったような気がします。そちらを参考にしてみてはいかがでしょうか？

kitを使用してうまくいかない場合、メーカーに問い合わせるのが一番早いのではないかと思います。

QuikChangeでPCR後もサンプルの増幅が見られません 削除/引用
No.2619-1 - 2009/01/09 (金) 15:21:37 - mm
QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kitを使って変異の導入を試みていますが、PCRの時点でコントロールと比較してほとんど増幅が認められません。
transformまでとりあえずやってみるものの、やはり何度やってもコロニーは認められず、プライマーの問題かと考え、場所や長さを変えて設計しなおしてみたのですがやはり増幅されません。

元々のベクターはpGL4で、それにかなりGC richな領域を2kb入れて作成したものでした。

この前のベクター作成の段階でも、GC richであったためか、様々な酵素でうまくPCRがかからず大変苦労したいきさつもあります。

今後どのような工夫をすればうまくいく可能性があるでしょうか？

よろしくおねがいします。
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