全13件 ( 1 〜 13 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.2586-13 - 2009/01/03 (土) 03:16:05 - おお >[Re:12] おおさんは書きました : 、 > 電気えいどう後固定して、そのまま蛍光活性をスキャンすれば、検出 > 感度が十分であればOKではないでしょうか。FITCは電荷持ってたっけ、、、、、 あ、脂質って固定できるかな、、、えいどう後そのまますぐに スキャンしたほうがいいかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.2586-12 - 2009/01/03 (土) 03:01:00 - おお >[Re:11] ボスを心から尊敬しています。さんは書きました : > おおさま > > > またLはタンパクではないので、RI標識を入れる事ができません。。 > たしかにタンパクであれば上手く行きそうですね。 ラベル入りで特注になるかとおもいます。 また、よく使われるものはラベルが入ったものが商品化されています。 > > >Lを抗体以外で検出可能ならELISAプレートにPをはっつけて、 > Lを加えあらってから、Lを抽出して測定してしまった > ほうが > > この場合の抽出というのはELISA plateからLを溶出するということですね。...剥がすというのが定法でしょうか？勉強不足ですみません。 定法とかいうのではなく、有機溶媒とかで抽出して液クロとかで定量するみたいな感じです。 プレートに残っていれば検出できる(感度が十分だったら)だろうということですが、、、 > > >あと分子量におおじて、蛍光の偏光角度が変わるのを利用して > > LにはコマーシャルなFITC標識が売られています。 > 具体的にどのようなtermで検索すればおおさまが仰られておられる実験法を調べることができますでしょうか？情報をいただけると嬉しいです。 http://www.takara-bio.co.jp/goods/bioview/pdfs/37_12.pdf > > > >LがPVDFなどの膜にしっかり転写されるなら、 > 一番シンプルな、Lオンリー、LとPのミックス > でゲルシフトが一番シンプルで実験がしやすい > とおもいますが、、、、 > > Lは中々電気泳動で再現性が高く流れてくれませんので難しいかもしれません。Lはタンパクではなく脂質なためです。でも勉強になりました。ありがとうございます。 流れないなら都合がある意味よくありませんか? Lだけであれば流れないのでウェルの底に検出されるか、シグナルがえられない。 タンパクに結合すればタンパクとこマイグレートするので、ゲル中に検出される。 いずれにせよ、移動度に違いが得られます。FITCラベルが手に入るなら、 電気えいどう後固定して、そのまま蛍光活性をスキャンすれば、検出 感度が十分であればOKではないでしょうか。FITCは電荷持ってたっけ、、、、、

(無題) 削除/引用 No.2586-11 - 2009/01/03 (土) 01:29:11 - ボスを心から尊敬しています。 おおさま >原理的にありかと思います。うまくいくと良いのですが、 ちょっと嫌な予感がします。まずELISAでうまくいってない ですよね。ということはLに対する抗体はLとPが結合して いる時Lにアクセスできない可能せいがないかなぁと、、、 V5 tagに対する抗体で検出していますが、おおさまの仰られる可能性については全く考えておりませんでした。ありがとうございます。 またLはタンパクではないので、RI標識を入れる事ができません。。 たしかにタンパクであれば上手く行きそうですね。 >Lを抗体以外で検出可能ならELISAプレートにPをはっつけて、 Lを加えあらってから、Lを抽出して測定してしまった ほうが この場合の抽出というのはELISA plateからLを溶出するということですね。 この場合の溶出というのは、RIで標識していないLを過剰に加えたりすることで（RI標識のLを）剥がすというのが定法でしょうか？勉強不足ですみません。 >あと分子量におおじて、蛍光の偏光角度が変わるのを利用して 蛍光の偏光角度を検出してライがんドのあふぃにティーを検出 する方法があります。 >これも小分子に蛍光ラベルを入れて、タンパクなどを加える ことで大きく偏光角度が変わります。 LにはコマーシャルなFITC標識が売られています。 具体的にどのようなtermで検索すればおおさまが仰られておられる実験法を調べることができますでしょうか？情報をいただけると嬉しいです。 >LがPVDFなどの膜にしっかり転写されるなら、 一番シンプルな、Lオンリー、LとPのミックス でゲルシフトが一番シンプルで実験がしやすい とおもいますが、、、、 Lは中々電気泳動で再現性が高く流れてくれませんので難しいかもしれません。Lはタンパクではなく脂質なためです。でも勉強になりました。ありがとうございます。 あいうえおさま 蛍光クエンチングという方法初めて聞きました。 原理等これから勉強しますが、いくつか試す事ができそうです。 LにはFITC標識がありますので、それを用いて出来そうな気がします。 これから蛍光クエンチングについて勉強しますが、また分からない事があればここで質問してもよろしいでしょうか、みなさま本当にありがとうございました。本年もどうぞ宜しくお願いいたします。

(無題) 削除/引用 No.2586-10 - 2009/01/03 (土) 01:26:59 - ボスを心から尊敬しています。 banさま >Lを埋め込んだゲルに抗体を電気泳動すれば、親和性を持つ抗体は、持たないものと比べて移動度が遅くなるんじゃないでしょうか。混ぜて泳動するよりも移動度の変化は、結合解離が繰り返し起きる分、大きくなるような気がします。 初めて聞く実験法ですね。しかし、この場合、電気泳動中にLも泳動されてしまわないでしょうか？アドバイスありがとうございます。 カナマイシンさま ここ数日BIACOREを考えておりました。低分子を固定化して、高分子をアナライトとして用いる条件に持っていけそうです！！アドバイスありがとうございます。ゲル濾過についても共同研究者からご助言いただけました。

(無題) 削除/引用 No.2586-9 - 2009/01/02 (金) 18:47:13 - おお >[Re:8] あいうえおさんは書きました : > リガンドの性質によりますが、 > 蛍光クエンチングはどうでしょう。 > 290nmくらいのexで、蛋白質内のTyrの > em. 340くらいをみます。 > くっつくものによっては、また、 > くっつきかたによっては、この蛍光が > 消失していきます。 これもいいアイデアですね。知恵を絞ればいくらでも でてくるってもんですね(いつもそうとかぎらないかもですが)

(無題) 削除/引用 No.2586-8 - 2009/01/02 (金) 17:18:21 - あいうえお リガンドの性質によりますが、 蛍光クエンチングはどうでしょう。 290nmくらいのexで、蛋白質内のTyrの em. 340くらいをみます。 くっつくものによっては、また、 くっつきかたによっては、この蛍光が 消失していきます。

(無題) 削除/引用 No.2586-7 - 2009/01/01 (木) 03:22:20 - カナマイシン >おお様 LオンリーとLPミックスで泳動 →膜転写 →抗体で検出 →両者の位置に差があることを見る という流れですか？ 確かにそれが一番直接的ですね。自分で気付けなかったのがちょっと残念です。 低分子だけを泳動するという概念が欠如していました。 BIACOREの件はすみません（笑） 恨みがあるわけではないのですが、私は周囲は試してもことごとくダメで… いや、これはやっぱり恨みですね。 周囲に上手な人がいてアドバイスを受けられるのなら やってみる価値がとてもあると思います。

(無題) 削除/引用 No.2586-6 - 2009/01/01 (木) 00:14:35 - おお >[Re:4] カナマイシンさんは書きました : >「そんなときはBIACOREの出番です！」 いやほんとそうですよ、、、って業者かおれって、、、 あと分子量におおじて、蛍光の偏光角度が変わるのを利用して 蛍光の偏光角度を検出してライがんドのあふぃにティーを検出 する方法があります。 これも小分子に蛍光ラベルを入れて、タンパクなどを加える ことで大きく偏光角度が変わります。 ま、タンパクにラベルを入れた方がやりやすいかもしれませんが、 その辺はやってみないと分からないかもしれません。 あと、ゲルシフトに話に戻っちゃいますが LがPVDFなどの膜にしっかり転写されるなら、 一番シンプルな、Lオンリー、LとPのミックス でゲルシフトが一番シンプルで実験がしやすい とおもいますが、、、、

(無題) 削除/引用 No.2586-5 - 2008/12/31 (水) 23:57:01 - おお >[Re:2] ボスを心から尊敬しています。さんは書きました : > 日本語がおかしかったので、訂正いたします。申し訳ありません。 > > Lは小分子であるにも関わらず、もし、抗体と抗原反応でNative-PAGEでband shiftが起こるのであれば、 > > 実際の結合予想タンパクPとも（Lとの結合で）band shiftが起きるのでは？と考えた次第です。 > > 原理的にありかと思います。うまくいくと良いのですが、 ちょっと嫌な予感がします。まずELISAでうまくいってない ですよね。ということはLに対する抗体はLとPが結合して いる時Lにアクセスできない可能せいがないかなぁと、、、 サンプルにどの程度余裕があるか分かりませんが、 やってみることは、そんなに手間と思えませんので 止めるわけではありませんが、参考程度に。 あとLにラベルを入れるのが手っ取り早いと思います。 RIが一番実験としてシンプルです。 またLを抗体以外で検出可能ならELISAプレートにPをはっつけて、 Lを加えあらってから、Lを抽出して測定してしまった ほうが直接的のような気がしますね。

(無題) 削除/引用 No.2586-4 - 2008/12/31 (水) 23:23:23 - カナマイシン 私はよくEMSAをやりますが、その経験から考えるに 1 kDaの分子量の変化はちょっと厳しいんじゃないかという印象を持ちます… 業者だったら「そんなときはBIACOREの出番です！」と言うのだと思います。 センサーチップに固定する側が低分子であればあるほど、 また流す側が高分子であればあるほど原理上は高感度なので、 今回の例ではLをチップに固定、Pを流すことでBiaCOREの得意な 条件に持って行けると思います。 これなら定量的にも評価できるはずです。 ただ周囲でしっかりと成功した人を見たことがないのでなんとも言えません。 あとはLを32Pなり14Cなりでラベルして、 ゲル濾過でPとLのフラクションが一緒になることを示す、とかですかね。 IgGのバンドシフトというのは、例えば http://www.fukui-med.ac.jp/crl/REPORT/kiseiken12.pdf　の図1における Super Shift シグナルみたいなイメージでしょうか？ これなら、PとLの結合様式によってはうまくいくのかもしれません。 もっとも、Lが抗体によってPから引きはがされてしまう可能性もあるような。 あまり抗体の実験に詳しくないので、 特に最後に関しては的外れでしたらご指摘ください。

(無題) 削除/引用 No.2586-3 - 2008/12/31 (水) 22:44:45 - ban Lを埋め込んだゲルに抗体を電気泳動すれば、親和性を持つ抗体は、持たないものと比べて移動度が遅くなるんじゃないでしょうか。混ぜて泳動するよりも移動度の変化は、結合解離が繰り返し起きる分、大きくなるような気がします。

(無題) 削除/引用 No.2586-2 - 2008/12/31 (水) 18:28:07 - ボスを心から尊敬しています。 日本語がおかしかったので、訂正いたします。申し訳ありません。 Lは小分子であるにも関わらず、もし、抗体と抗原反応でNative-PAGEでband shiftが起こるのであれば、 実際の結合予想タンパクPとも（Lとの結合で）band shiftが起きるのでは？と考えた次第です。

中性電荷ligandと結合予想タンパクとの結合をnative PAGEで評価 削除/引用 No.2586-1 - 2008/12/31 (水) 18:18:57 - ボスを心から尊敬しています。 お世話になります。 今年も今日で終わりですね、今年もこのサイトでたくさん勉強をいたしました。 いつもありがとうございます。 現在、私どもの研究室にて、あるligand (L)とおそらく結合するであろうタンパク(P)の相互作用を証明できないか色々試してまいりました。 どうも結合が弱いらしく（あるいは結合しないという可能性もありますが）、ELISAではうまくいかないことがわかりました。 またPを供与していただいた研究室の先生からはNative-PAGEでbandがシフトするかで評価したらというアドバイスをいただきました。 ここで、皆様のお知恵をお借りできたらと思います。 そのLというのは電気的に中性であり、Pとたとえ結合したとしてもシフトが起こるのかな？と疑問に感じてています。Native-PAGEを用いた証明にそこまでこだわるわけではありませんが、ひとつ考えたアイデアがあります。 それはPがLと結合することで分子量が変わることを利用してNative-PAGEでバンドのシフトが確認できないか？ということです。（電気的な変化はないにしろ） ただligandは小分子で1kDa程度です。 bandシフトは見えないかもしれませんが、見えるかもしれません。あるいはLは電気的に中性だと言われていますが完全に中性かどうかはわかりません。 そこでみなさまにお尋ねします。 Lが結合タンパクと結合してband shiftが起こるかを別のアプローチで予想できないかを考えました。それは「L」と「Lに対するモノクロ」との結合をNative-PAGEで評価するというものです。 それで、Native-PAGE後、HRP-anti-IgGでIgGのband shiftを観察するというものです。 もし、抗体と抗原反応でNative-PAGEでband shiftが起こるのであれば、実際の結合予想タンパクPとのband shiftで結合を評価できないか？と考えた次第です。 みなさまいかがでしょうか？質問がふわふわしていて申し訳ありません。 電気的に中性のLとその結合タンパクとの相互作用をNative-PAGEでは絶対に評価できないか？というのが質問の中核です。

全13件 ( 1 〜 13 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

---