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(無題) 削除/引用 No.2560-12 - 2008/12/26 (金) 20:46:04 - サッカロ 弘法さんへ はい。その論文を参考にしています。 論文より、たくさん生えてきたコロニーを新しいプレートに一つずつ引きなおして（３０〜１００程）生えてきたものをＰＣＲ確認するものだと解釈していました。なので、たくさんコロニーがあるのに一つ一つするのはおかしいなと思っており、思いとどまっていました。 本当にありがとうございました。 生えてきたコロニーを水で回収し、希釈して、もう一度まくという方法を行なおうと考えています。 でも、滅菌したろ紙をコロニーの上に貼り付けて剥がし、新しいプレートの上に貼り付けて剥がすという方法も考えてみます。

(無題) 削除/引用 No.2560-11 - 2008/12/26 (金) 11:41:44 - 弘法 G418濃度は参考になさっている論文に従うべきだと思います。 また、参考になさっている論文が次のものなら、マイクロコロニーがバックに一面に出た場合の対処法についてもきちんと記載されていますよ。 Nucleic Acids Research, 1996, Vol. 24, No. 13 2519–2524 A new efficient gene disruption cassette for repeated use in budding yeast Ulrich Guldener, Susanne Heck, Thomas Fiedler, Jens Beinhauer and Johannes H. Hegemann

(無題) 削除/引用 No.2560-10 - 2008/12/25 (木) 22:25:04 - サッカロ 元酵母使いさんへ 私も前の研究ではアミノ酸で選択をかけ、破壊株を取得していました。 しかし今の研究では、ある論文の手法を用いています。 それではｃｒｅ−ｌｏｘＰシステムを用いるのですが、あるプラスミドのｋａｎＭＸの外側にｌｏｘＰ配列が存在し、その更に外側に相同領域３５ｂｐを持つプライマーを設計し、一度のＰＣＲで破壊カセットを作製しています。アミノ酸となると、わざわざクローニングすることになってしまうので、この系のままで使えるようにＧ４１８を用いています。

(無題) 削除/引用 No.2560-9 - 2008/12/25 (木) 21:34:16 - 元酵母使い 以前ルーチンに酵母を使っていたときはロイシン、トリプトファン、ウラシルなどの栄養要求性を指標に破壊株を取ってました。 栄養要求性マーカーの両端に破壊したい遺伝子の数十塩基を付けたPCR断片でトランスフォームしてSD培地にプレーティングするだけ。 周りはみんな栄養要求性で選択していて、特に難しいこともなかったのですが、薬剤耐性で選択する理由は何かあるのですか？ 栄養要求マーカーの相補選択、簡単ですよ。

(無題) 削除/引用 No.2560-8 - 2008/12/25 (木) 19:18:53 - サッカロ もう一つ聞きたいのですが、この場合Ｇ４１８の濃度はどのぐらいにするものなのでしょうか？ 濃度が高すぎると問題はあるのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.2560-7 - 2008/12/25 (木) 18:09:46 - サッカロ 弘法さんへ ありがとうございました。 明日で今年の研究は終わるので、来年から是非実践させていただきます。 また、なにか疑問が出たときはよろしくお願いいたします。 本当にありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.2560-6 - 2008/12/25 (木) 16:56:48 - 弘法 あ！ 原核生物の研究をしているラボなら、レプリカはお手のものではないですか？

(無題) 削除/引用 No.2560-5 - 2008/12/25 (木) 16:54:53 - 弘法 希釈はもちろん必要です。沢山生えてるコロニーの中に１個だけでもG418耐性のものがあったら、次のプレートには一面にそれが生えるでしょう。 同じ理由で、同じプレートに由来するものを何枚にもまき直すことにはあまり意味があるとは思いません。別のプレートに由来するものを別々にまき直し、それぞれから取れたものは独立のクローンだと判断するということになると思います。 どのくらい希釈すれば良いかはやってみないと分からないので、1/1,000、1/10,000、1/100,000程度で様子を見てみてはどうでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.2560-4 - 2008/12/25 (木) 16:45:01 - サッカロ 引法さんへ お返事ありがとうございます。 Ｇ４１８の選択培地に生えてきた、数え切れないほどのコロニーのプレートに、無菌水１ｍｌ加えコロニーをコンラージ棒でかき集め、新しいプレートにまくという方法で大丈夫でしょうか？？ 希釈したほうがいいのですか？その場合はやっぱり何枚もまいた方がいいですか？ 他の株では、数え切れないほどコロニーが生えるということは無く、Ｇ４１８で選択かけることができたのですが。 株によって異なってくるのですね。

(無題) 削除/引用 No.2560-3 - 2008/12/25 (木) 12:13:48 - 弘法 形質転換後、G418プレートにまき出すと一面に生えることは確かにありますね。でも、大部分は死にながらコロニーを作っているものなので、これをもう一度同じプレートにレプリカするとバックが死んできれいに形質転換体のコロニーが残ってきます。 レプリカ台とベルベットを使えれば一番良いのですが、手許に無いようでしたら滅菌したろ紙をコロニーの上に貼り付けて剥がし、新しいプレートの上に貼り付けて剥がすことでレプリカできるのではないでしょうか。 それも面倒なようだったら、一面のコロニーを水で洗い集め、希釈してもう一度同じプレートにまいても良いと思います。クローンの独立性は失われてしましますが。

(無題) 削除/引用 No.2560-2 - 2008/12/25 (木) 10:27:48 - サッカロ ちなみに、今用いている株が他の株と違って、凝集性的な現象（液培すると、底に溜まりやすいです）があります。 これが関係しているのでしょうか。

酵母の形質転換 削除/引用 No.2560-1 - 2008/12/25 (木) 10:23:32 - サッカロ 酢酸リチウム法を使い、選択培地をＹＰＤ＋Ｇ４１８にし破壊株（サッカロ）を取得しようと試みています。 Ｇ４１８を５００〜１５００μｇ／ｍｌの濃度で色々と行なっていますが、どれも数え切れないほどのコロニーが生えてきてしまいます。 また、コントロールとして破壊カセットなしで形質転換し、まいたらこちらも数え切れないほどのコロニーが生えてきてしまいました。 ちなみに、用いている株を液培し、５００〜１５００μｇ／ｍｌのＧ４１８のプレートにまいてどれもちゃんと生えてこないのを確認済みです。 通常では、Ｇ４１８に阻害がかかっているのに、形質転換となると生えてきてしまうのはなぜですか？ どなたか、よろしくお願いします。 私の大学で酵母の研究をしている人がいなく、研究室でさえ私一人だけです。研究室の先生は、原核生物の先生で、酵母に関してまたっく何も知らないに近いです。 誰にも聞く相手がいなっかたので、今回投稿しました。

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