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(無題) 削除/引用 No.2553-3 - 2008/12/25 (木) 10:03:00 - microscopy やはり、プラスミドは増幅しない、で合ってるのですね。。。 トランスフェクション効率もトランスフェクション後のバイアビリティも低いので、細胞はまばら、GFP＋はさらにまばらです。 そのGFP+が緑のコロニーを作ってます。 蛍光強度を顕微鏡ではかってみますが、たぶん、分裂しながら蛍光タンパクが分配されている、ということですね。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.2553-2 - 2008/12/24 (水) 15:32:11 - おお 効率がいい時は1週間もつかもとおもいます(トータルのライセイトでウエスタンするとたしかに減少しているでしょうけど)。トランスフェクションして1ー2日後はどうでしたか?もしかしたら効率50-100%に近いぐらいまであって、それが徐々に発現が落ちてきて、強く発現しているのがコロニーのように見えるといったことはないでしょうか?あるいは、強く発現しているものは増殖スピードがおちて、そのため発現が長持ちしているとか,,,,, 安定株を作る時、効率がいいばあいは10cmに1000個以上生えてくることもありますので(あくまでもセレクションしての話ですが)、もしかしたら、インテグレーションされているかもね。

トランジエント発現の持続（GFP-fusion) 削除/引用 No.2553-1 - 2008/12/24 (水) 11:09:20 - microscopy pEGFP-N1を使ってGFP融合タンパク質を、初代培養から自分たちで樹立した細胞株に発現させています（T-antigenは持っていません） T-antigenがなければpEGFP-N1プラスミドは複製しない、と思っていたのですが、一週間経って、GFP-positiveの単一細胞がコロニーを作りながらどんどん増えているのですが、そのコロニーの細胞はほとんどGFP-positiveです。（環状プラスミドのままfugeneHDでトランスフェクションしています） タンパク、メッセンジャーの安定性に依存するとは思いますが、一般に、発現はどれくらいの期間持続しますか？ 偶然ゲノムに入ったのを除けば、いずれはプラスミドを失って発現しなくなるのですよね？？？

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