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(無題) 削除/引用 No.2544-13 - 2009/03/20 (金) 14:25:07 - AP 質問から時間がたっているし、当フォーラムのメインサイトも変わってしまったので役に立つかわかりませんが、他の勉強をしていて思い出したことがあります。 recipientのBACをlinearかつ、つなげたい領域の両端とそれぞれ相同な配列が末端にくるようにしたものを、donarのBACをもつ大腸菌に導入すると、Gap修復（double strand breakの相同組換え修復）の系が働き、recipient BAC末端の相同配列間がdonarの配列で補われることを利用して、単一クローンがカバーする領域を広げていく方法があります。

(無題) 削除/引用 No.2544-12 - 2008/12/23 (火) 09:24:30 - 弘法 YACをhomologous recombinationで繋いでいって、2.4 Mbのヒトゲノム領域をカバーするクローンを作ったという論文があります。 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/1301131?dopt=Abstract 分野外でよく知らないのですが、BACでもRed/ETで繋いだというような仕事があるのではないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.2544-11 - 2008/12/23 (火) 03:51:46 - おお >[Re:10] まるこむさんは書きました : > でも膜で透析のみってのは、 > 聞いたことなかったです。 少し思い出しました。で訂正があります。 コロジオン膜に細胞を溶解した液をいれ、 膜の外側に閉鎖空間を作りそこを吸引 して、陰圧にするというものだった と思います。膜はオープンにしておいて、 バッファーをどんどんつぎ込んで精製 していく方法だったと思います。 マンマルの細胞でよくやられていた 方法だったと思います。しかし、高分子 のとう鎖などを多く含む場合は、それらの 分解などひと工夫いるかもしれません。

ゲノム抽出。。。 削除/引用 No.2544-10 - 2008/12/22 (月) 23:41:05 - まるこむ アガロースに包埋したり、 結構検討したんですよ。。。 大腸菌は余裕ですし。 でも膜で透析のみってのは、 聞いたことなかったです。 ちょっと調べてみます。 なんとなくアガロースに包埋に勝てる理由は見当たりませんが。 ザンギさんの手も考えてたんですけど、 たとえば80kbまでつないで、 20、10、30、20、に切れる候補があって、 パーシャルで切って80だけをつって来て後の20をつなぐって考えると、 かなり苦労はしそうですよね。。 もちろん50、50のように半々でつくってつなぎますけど。。。 なんてネガティブな雰囲気。 すみません。 他にアイデアある人いましたら大募集！ 急募！！ おねがいします。

(無題) 削除/引用 No.2544-9 - 2008/12/22 (月) 22:14:55 - ザンギ Pumpkinさんの方法で、結合したクローンを切り出すときに部分消化して、真ん中で切れてない断片を分離して次の断片をつないでいくのが一つの方法ではないでしょうか。 スフェロプラスト法などでがんばって長いゲノムDNAをとるほうがいいように思いますが、株によっては不可能な場合もあるのでしょうね。

(無題) 削除/引用 No.2544-8 - 2008/12/22 (月) 22:14:20 - おお >[Re:3] まるこむさんは書きました : > 目的は特定の細菌の特定の100kbにわたる領域のクローニングです。 > (全ゲノム解読済) > 様々なゲノム抽出法を検討しましたが、 > 得られるサイズはいつも30kbp程度と、 長いゲノムのライブラリーを作る時は、遠心やエタチンを避けます。 これらは切断の原因になりますから。細胞を溶解して、ひたすらコロジオン 膜で透析して精製するというプロトコールを見たことがあります。 もレクロの前のエディションに載ってたと思います。いまのやつでは 調べたことがないですが、あると思います。 もしまだこの方法をためしてないようでしたら、 ご参考までに

(無題) 削除/引用 No.2544-7 - 2008/12/22 (月) 21:27:40 - Pumpkin ゲノムは読めているということなので、適当な大きさになる位置に、しかも、いくつかの断片になるすべての断片でかぶらない制限酵素を使ったライブラリーを作って、それぞれの目的のインサートが入ったクローンを釣り上げて・・・ハァ-.-)y-~

痛い 削除/引用 No.2544-6 - 2008/12/22 (月) 21:18:52 - Pumpkin そりゃ、そうですね。痛い話をしてしまいましたね・・・疲れてるかも。

うーむ 削除/引用 No.2544-5 - 2008/12/22 (月) 19:50:55 - まるこむ それは考えたんですけど、 これだと、先にクローニングしてたやつも切れちゃうので、 かなり面倒ですよね。。。 解釈が違いますでしょうか??

(無題) 削除/引用 No.2544-4 - 2008/12/22 (月) 19:36:51 - Pumpkin あるレアカッターで消化したgDNAのライブラリーを構築して、そのインサートを1個つなげてはクローニングし、正しい結合順のものを選択。これを繰り返していく。いっぺんにやると大変なことになりますが、2つのインサートづつだったら当る確率は1/2に近いと思うのでどうでしょう？レアカッターが2つ適当な位置にあれば、いくつかディレクショナルにはいるでしょうか。

詳細です 削除/引用 No.2544-3 - 2008/12/22 (月) 18:22:51 - まるこむ 目的は特定の細菌の特定の100kbにわたる領域のクローニングです。 (全ゲノム解読済) 様々なゲノム抽出法を検討しましたが、 得られるサイズはいつも30kbp程度と、 そこから部分消化してライブラリーを構築しても、 20kbp程度の平均インサート長のライブラリーしか獲得できません。 そこで、部分消化ですとジャストで当てはまるインサートの獲得に、 苦労しそうなので、 レアカッターで完全消化して、 それらを連結すれば、 目的の100kbpを獲得できると考えたわけです。 しかしその連結法が解決しません。 ご理解いただけますでしょうか？ よろしくお願いいたします。

(無題) 削除/引用 No.2544-2 - 2008/12/22 (月) 16:59:10 - おお ライブラリーなのか、特定のDNA断片なのか、というところが 明確でないですが、タイトルを無視するとどうも特定の ものではないかと思えます。 ゲノムのライブラリーなどは、制限酵素でパーシャルできって、 欲しいDNAサイズをゲル濾過や電気えいどうできりだして 調せいすることもありますので、パーシャルで切って インサートするのが第１選択のようなきがしますが どうでしょうか、、、、

ゲノムライブラリーのインサートを連結したい 削除/引用 No.2544-1 - 2008/12/22 (月) 16:28:59 - まるこむ いつも大変参考にさせていただいております。 相談させていただきたいことがございます。 100kbp程度のバクテリアゲノム由来のインサートを BACにクローニングしたいと考えてます。 しかしながら利用している細菌から 100kbpを超えるDNA断片を獲得することが難しく、 現在レアカッターを用いて完全消化して、 たとえば20kbp程度のものを獲得し、 後で連結したいと思っております。 しかし向きの問題や複数の断片を連結したいので、 なかなか方法論が浮かびません。 どなたかこういった際に用いる方法をご存知でしたら、 教えていただけたら大変助かります。 よろしくお願いします。

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