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QIAprep Spin Miniprepで精製したプラスミドが使えるか 削除/引用 No.2532-6 - 2008/12/25 (木) 16:13:23 - こば ご助言をいただいた皆様へ QIAprep Spin Miniprepで精製したプラスミドがトランスジェニックマウス作製に使えるかについて、キアゲンのサポートから回答がありました。 トランスジェニックマウス作製に当たっては、最も精製度の高いプラスミドを精製できるEndoFree Plasmid Kitの使用を推奨されました。このキットを使えば、大腸菌由来のエンドトキシンを除去したプラスミドが精製できるそうです。なお、プラスミドを直鎖状にした後で使QIAquick Gel Extraction Kitは、使用できることを案内しているそうです。 まずは数日間培養を延長してから発現を観察し、次にミニプレップのキットを替えてやってみます。これでうまくいかなければ、また相談いたします。皆様どうもありがとうございました。

ご助言ありがとうございます 削除/引用 No.2532-5 - 2008/12/22 (月) 19:24:38 - こば おお様、EcoRI様、さっそくご助言をいただき、本当にありごとうございます。 おお様からご指摘いただいた点について １．QIAprep Spin Miniprepがトランスフェクションに利用可能か 英文マニュアルで確認したところ、マンマルのトランスフエクションに利用可能とは明記してなかったので、QIAGENのサポートセンターに問い合わせました。 ２．シーケンスのテンプレートはプラスミドの方がよい プラスミドでシーケンスを行い、確認したことを書きそびれていました。仰せのとおりです。 ３．２細胞期では観察が早すぎる ご指摘のように、２細胞期は胚ゲノムが活性化する時期なので観察が早すぎたかもしれません。もう1〜2日培養して観察してみます。今回の実験はインジェクション法によるTg系を立ち上げ、分析のためのグリーンマウスを作ることが目的です。 EcoRI様からご指摘いただいた点について まずは数日間遅らせて観察を行い、それでもうまくいかない場合、同じ核酸鎖を適当な細胞に導入することを考えてみます。

(無題) 削除/引用 No.2532-4 - 2008/12/20 (土) 14:32:20 - おお >[Re:1] こばさんは書きました : 読み返して気になるところ何点かありましたので、追記いたします。 > > １．大腸菌を14時間培養し、QIAprep Spin Miniprepでプラスミドを回収。 このキットで得られたプラスミドを導入に使ってますか? マンマルのトランスフェクションにどこまで使用可能なのか キットのマニュアルで確認を取られた方がいいかもしれません。 > ５．短時間のUV照射下でEGFP cDNAを含むはずの3180bpと思われるバンドを切り出し、QIAquick Gal Extraction Kitで抽出。カラムからの回収は滅菌超純水を使用。この断片でPCR、シーケンス行って、EGFP cDNAが含まれていることを確認しました。 目的のDNA断片と考えられるものがプラスミドに 見られるというのは1ステップクリアーしたと いえますが、シーケンスはプラスミドをテンプレート にした方がいいと思います。 > ７．前核がふくらんだ卵子を培養し、2細胞期に蛍光顕微鏡でEGFPの発現を観察。フィルターはGFP用のものを使用しています。 2細胞期はまだ転写という意味では早いようなきがします。 マンマルは比較的早く転写が活性化するので、しばらく 培養してみてはとおもいますが、、、目的にかなっている かどうか分かりませんが、、、 実験の目的は何でしょうか、、EGFPを発現させる ことではないとおもいますが、、、、

(無題) 削除/引用 No.2532-3 - 2008/12/20 (土) 14:14:01 - EcoRI 同じ核酸鎖を適当な細胞に導入してGEPの蛍光をみてやれば、 核酸鎖の問題なのか、卵子の転写活性の有無が問題なのかはわかるように思います。

(無題) 削除/引用 No.2532-2 - 2008/12/20 (土) 11:51:02 - おお 卵子ということなので、転写活性などがまだ活性化してないのでは?

EGFP遺伝子を注入したマウス胚が光らない 削除/引用 No.2532-1 - 2008/12/20 (土) 09:50:57 - こば pCX-EGFPを制限酵素処理し、EGFP cDNAを含む断片をマウス前核期卵子に注入しているのですが、2細胞期でEGFPの発現を示す蛍光が5%以下の胚でしか観察されません。注入操作には問題なく、pCX-EGFPに改変も加えていませんpCX-EGFPを含む大腸菌のオリジナルは阪大より分与されたもので、PCR、制限酵素処理、シーケンスによる確認で菌の取り違えはないと思います。遺伝子の調整法に問題があるのではと考えています。調整法は以下の通りです。どなたかご助言いただきたくよろしくお願いいたします。 １．大腸菌を14時間培養し、QIAprep Spin Miniprepでプラスミドを回収。 ２．BamHIで制限酵素処理し、3M酢酸ナトリウム（pH5.2）を用いてエタ沈後、冷蔵庫で一晩かけて滅菌超純水に溶解。 ３．Sal�Tで制限酵素処理し、65度15分の熱失活。前記と同様にエタ沈し、冷蔵庫で一晩かけて滅菌超純水に溶解。 ４．1.5%アガロース（UrtlaPure Agarose, Invitrogen）で泳動し、30分エチブロ染色。 ５．短時間のUV照射下でEGFP cDNAを含むはずの3180bpと思われるバンドを切り出し、QIAquick Gal Extraction Kitで抽出。カラムからの回収は滅菌超純水を使用。この断片でPCR、シーケンス行って、EGFP cDNAが含まれていることを確認しました。 ６．DNA溶液を分注して冷蔵（3日以内）または凍結保存し、使用時に滅菌超純水で1µg/ml調整して前核に注入。 ７．前核がふくらんだ卵子を培養し、2細胞期に蛍光顕微鏡でEGFPの発現を観察。フィルターはGFP用のものを使用しています。

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