BioTechnicalフォーラム [IEFゲルのpH測定]

IEFゲルのpH測定

No.2527-TOPIC - 2008/12/19 (金) 09:32:54 - EcoRI

いつも大変お世話になっております。

IEFゲルのpHを測定しようと考えております。

羊土社の実験書を参考にして(というか、そのまま適用して)
泳動終了後のゲルを5mmに切り分け、
それぞれを500ulの脱気した蒸留水につけ込み、しばらく待って
水溶液のpHを測定すればよかろう、と考えました。

しかし、当ラボに、500ulという少量のpHを測定できる機器はなく当惑しております。
ゲルを付ける水の量を大きくすれば、もちろん測定できるのですが、
どの程度まで許容されるのか、わかりません。
大きくすると、測定されたpHがゲルのpHを反映しないように思います。

みなさまのプロトコルやアイディア、意見を伺いたく思います。
　

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(無題)

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No.2527-13 - 2008/12/22 (月) 10:57:10 - EcoRI

mom-a 様、ありがとうございます

>「蒸留水のpHはpHメーターで測れない」というのはそのことかな？と思ったのですが、だとすると、2行目以下の「とりあえず測定」は…？
仰る通り、正確な値を得ることはできませんでした。小数点以下２桁がぶれます。
測る日によって、変動します。(気温が関係している？)

「とりあえず測定」というのは
ゲルの断片を入れないで500ulの蒸留水だけをチューブに入れて、空気中から溶け込む物質の影響も
考慮に入れて、蒸留水(?)のpHを測定すればいいのかな、と。

>もともと不安定は測定値で補正するくらいなら、No.2527-8で名無しさんがおっしゃるように、pH試験紙で0.2刻みで測定できるのでその方が良いような気が…
そうですね。
もう少し考えた方がいいかもしれません。

IEFで、サンプルを負荷するものとしないものを作って、
side-by-sideで流して、しかるのちに、IEFゲルのpHを測れば、
うまくpIが算出できるのではないかと思うのですが。

うーん、なかなか難しいですね。
ごく微少量の中性な電解質(NaClなど)の水溶液を用いて、pH測定することも考えたのですが、
そういった塩が、両性担体に与える影響もわかったものではないですし。
やってみる価値はあるのでしょうが…。

精製水のpH

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No.2527-12 - 2008/12/22 (月) 10:31:08 - mom-a

>蒸留水のpHはpHメーターで測れないことに気づきました。
>とりあえず、蒸留水のpHを測定して、みかけのpHとして、それをblankとして、あとから補正すればいいのかな、と思いますが、どうでしょうか…

精製の度合いにもよりますが、精製水はかなりpHの変動が大きい（溶け込んでいるイオンが極少なので空気中の二酸化炭素などが溶け込みやすい）のでpHを正確に測るのは無理、というようなことを業者さんに言われました。
「蒸留水のpHはpHメーターで測れない」というのはそのことかな？と思ったのですが、だとすると、2行目以下の「とりあえず測定」は…？

もともと不安定は測定値で補正するくらいなら、No.2527-8で名無しさんがおっしゃるように、pH試験紙で0.2刻みで測定できるのでその方が良いような気が…

(無題)

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No.2527-11 - 2008/12/22 (月) 09:48:53 - EcoRI

名無し様、たびたびありがとうございます

IEFや2D-PAGEに起因するスポットの取扱いについては、十分に承知しているつもりです。
尿素も、overlay溶液は１回使いきり、サンプルも調製時に小分けにして、
極力凍結融解は避けています

取り扱っているタンパク質にリン酸化などの翻訳後修飾の情報は知られていないので、
とりあえず、単一のスポットとして扱うようにしています。

話をIEFゲルに戻すと、
頂いたアドバイスも勘案して、いろいろ考えた結果、普通のpHの端子部にパラフィルムを巻いて、
微少量を測れるようにしましたが…
蒸留水のpHはpHメーターで測れないことに気づきました。
とりあえず、蒸留水のpHを測定して、みかけのpHとして、それをblankとして、
あとから補正すればいいのかな、と思いますが、
どうでしょうか…

(無題)

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No.2527-10 - 2008/12/20 (土) 17:18:28 - 名無し

横に広がったスポットですが２つの場合があります。ひとつはフォーカスに必要な泳動時間の不足、高濃度の塩などの夾雑物によるフォーカスの妨害、塩基性蛋白質など技術的あるいはIEFや2-Dの欠点に起因するものです。最近は塩基性領域のフォーカスや再現性を良くするようないろいろよいゲルストリップや添加試薬が出ているようなので多少金をかければ昔と比べればこういう問題は何とかなるのではと思います。もう一つは側鎖の翻訳後修飾などによるミクロヘテロジェネティによるものです。リン酸化のような荷電の入る修飾やアセチル化のように荷電のあるアミノ酸への修飾の結果、等電点が少しずつズレたことなどによります。複数箇所にこうしたことがおきると複数のスポットが近接して並んでつながって、一見よこにひろがった帯状に見えることがあります。このように判断できるスポットは2-Dしてるとしばしば目にします。（分離状態によってはディスクリートな連続スポットになることもあります）そのため単に量の多いところをそのスポットの代表の等電点とみなす場合は、せっかくの情報を見落とす恐れもあり注意が必要です。あと古くなった尿素の分解産物による修飾で似たようなアーティファクトが生じることもあるようなので、尿素を使うような時は注意してください。

(無題)

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No.2527-9 - 2008/12/20 (土) 14:34:51 - EcoRI

名無し様、ありがとうございます。

>pH試験紙のワイドレンジのやつと、ナローレンジのやつでやればどうかね。
なるほど…
確かに、それほどの厳密さは必要ないのかもしれません
５前半とか９前後、といった程度でいいのかもしれません
横に広がってしまうスポットなら、どこを取るかで変わって来そうですし

あ、横に広がってしまったスポットの場合、どこを等電点としてとるべきなのでしょう。
やはり一番太いところなのでしょうか。

(無題)

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No.2527-8 - 2008/12/20 (土) 14:27:47 - 名無し

だいたいpI7付近ですけど、とかそういう感じでいいなら、pH試験紙のワイドレンジのやつと、ナローレンジのやつでやればどうかね。pHは温度で動くし、条件合わせて厳密にやるとなるとなかなか大変でしょうし、そこまでして厳密なpI測定しないといけない理由でもあるなら別ですが。

あと売ってるpIマーカーは変性条件用のものと非変性条件用のものがあったはずなので注意。

(無題)

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No.2527-7 - 2008/12/20 (土) 14:03:54 - EcoRI

sin様、ありがとうございます。

そうですね、できないことも無いと思いますが
どれくらい定量性があるのかが問題となって来ますよね。

引き続き、アドバイスやご意見を承りたく存じます。

(無題)

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No.2527-6 - 2008/12/19 (金) 15:36:28 - sin

適当なpH指示薬で呈色させて、吸光度からpHを割り出せませんかね・・・。

(無題)

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No.2527-5 - 2008/12/19 (金) 15:08:35 - EcoRI

xx様、ありがとうございます

>http://www.jp.horiba.com/analy/b-211-212/d.htm
じつは、まさにこれがあるんですが…
長らく(少なくとも３年)放置されていて、復活を試みたのですが…
センサがダメになっているようでして