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(無題) 削除/引用 No.2508-10 - 2008/12/17 (水) 23:34:26 - 権兵衛 還元状態ではどうでしょうか。モノクロだと25kと50k付近にバンドがでるはずです。ポリクロだと25k付近のバンドはぶれやすいですが。

(無題) 削除/引用 No.2508-9 - 2008/12/17 (水) 05:40:16 - おお ウサギとマウスでどの程度ちがうかというのは一概に いえないとことがありますので、ウサギと比較して バンドの位置がどの程度の違いなら許容範囲というのは 一概に難しいです。アクチンなど非常にタイトに 保存される物から、意外と配列が種間で違うもの までピン切りですし、組織や細胞の由来などで 修飾その他でが違い違うところにバンドが出る ということもあると思いますから。 そういう意味では糖修飾は劇的にサイズを変化させそうなので 全く違うサイズというのも可能性がありそうです。 >[Re:6] ンJさんは書きました : > 目的の分子量はカタログ上は150kDaなのですが、140kDa付近にバンドがでます。 サイズマーカーは目安なので、比べる相手がないと サイズのさを明確にすることは難しいと思います。 あなたが使っているサイズマーカーで、厳密に 移動距離をもとに、サイズを算出しても、記載の サイズの求めかたが、目で見積もっただけとか、 違うサイズマーカーを使っているとかだと、とう 低比べようがないですよね。 つかっているえいどうのシステム(バッファー) とかの違いも影響するかもしれませんよ。 > 使用している抗体はPolyなのでバックグラウンドも暗くなりがちで > Non Specificなバンドも多くでてきます。 抗体の濃度を薄くするなど、状態の反応条件 ブロッキングなど厳しくするのも若干助けになるかと思います (もしまだ検討されてないようであれば) > > Positive Controlを同時に流していなかったので、まずそこから確認をしたいと思います。 慎重にコントロール(場合によってはポジティブ、ではなくて ネガティブあるいは両方)、を選ぶといいかとおもいます。 抗体はリコンビナントから得られたものでしょうか、合成 ペプチドからでしょうか?合成ペプチドのばあいエピトープ部位が 限られますので、その領域の配列が保存されていなければ スペシフィックなバンドは期待できない可能性があると 思います。

(無題) 削除/引用 No.2508-8 - 2008/12/17 (水) 05:23:43 - ンJ 私は7.5% gelとBio-RadのPPP Standerdを使っていて、 丁度150KDaのところにマーカーがあるのでずれていると感じてしまいます。 他の文献だと10% gelを使っており、おっしゃる様に区別が難しいため、 逆に私の結果で140KDaのところにでているバンドを目的のバンドとして 扱っているのでは無いかと疑ってしまいます。 どうしたものでしょう。。。

(無題) 削除/引用 No.2508-7 - 2008/12/17 (水) 03:58:47 - 名無し まずSDS-PAGEで140KDaと150KDaの差10KDaを分子量マーカーを頼りに区別できていること自体わたくしのは？なのですがどうでしょう。そのあたりかなりバンドが詰まってきていてそんな微妙な差が見えるだろうか？と。 たしかに大きい蛋白質だから分解うけるチャンスは多いかもしれないし、どっか切れたりすると分子量けっこうかわることはあるけど。LC/MSとかでやるとミオシン重鎖とかフロント付近の低分子領域にも検出されるし。（多分断片化したやつ）。またSDS-PAGEの分子量はかなり大雑把なものでSDSの付き具合とか、アミノ酸の偏りとかいろいろな要因もからんで必ずしも理論値にあうとはかぎらないことは時々あるのであまり振り回されるのもどんなもんかと。。

(無題) 削除/引用 No.2508-6 - 2008/12/17 (水) 02:40:26 - ンJ 詳細を書かずに申し訳ありません。 使っているのはマウスの骨格筋でこれをホモジナイズしてサンプルを作っています。 目的の分子量はカタログ上は150kDaなのですが、140kDa付近にバンドがでます。 使用している抗体はPolyなのでバックグラウンドも暗くなりがちで Non Specificなバンドも多くでてきます。 他文献もおっしゃる様にバンドしか掲載していないので実際にどこのバンドを採用しているのか 不明なのです。 Positive Controlを同時に流していなかったので、まずそこから確認をしたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.2508-5 - 2008/12/16 (火) 14:30:32 - 免疫屋 まず確認ですが，分子量が異なるというのはラビットとマウスのサンプルを同時に泳動した場合に10kDa違ってきてしまうということでしょうか？．それとも，カタログ情報から10kDa違ってきてしまうということでしょうか？ 後者の場合には，使用するマーカーや泳動条件などによって少々差が出てくる事はあり得ますので，見かけのサイズの違いでもって使えない抗体であるとは断言できないと思います． 次に，ラビットとマウスの配列からみてどの程度の差があるか確認されてはと思います．10kDa差はありえないかもしれませんが，それに近い差があるかもしれませんし． もう一つ，リン酸化の確認方法を提示されてはと思います． 抗リン酸化タンパク特異的な抗体なのか，あるいはIP後に抗pYなどで見ているのかによって抗体がちゃんと標的タンパクを認識するか否かの確認方法が異なってきますから．

(無題) 削除/引用 No.2508-4 - 2008/12/16 (火) 14:23:32 - 通りすがり まず、マウスとウサギという話ですが、糖鎖修飾が違ったりといったことはないでしょうか。 それから、ウサギのポジコンを同時に流していないのなら、何kDa違うかは正確にはわからない気もします。 元が20kDaのタンパクが30kDaに出るのと、100kDaのタンパクが110kDaに出るのとでは、違った推測になりそうですし。。。 さらに、リン酸化抗体でしたら、上流・下流などわかっていればリン酸化のtime course やdose responseなどの挙動を比較してノンスペかどうか推定できそうですが、論文にする際の証明にはなりにくいと思います。 …最近の論文は紙面の関係かバンド付近だけしか示さないので、挙動が似ていたらそもそも突っ込まれないかもしれませんが… りょうさんがおっしゃっているとおり、培養細胞にsiRNAを導入するのが早いかと思います。

(無題) 削除/引用 No.2508-3 - 2008/12/16 (火) 12:23:26 - りょう 抗体の特異性はかなりしっかり調べないと危険ですよ。 培養細胞などでノックダウン技術などを用いて証明するべきです。 blot,IP,染色で反応したと言っても他の蛋白にクロスしているだけかもしれないですし。 DNA配列情報などはデータベースから入手できるでしょうし、ORFなどお調べになって推測できることもあるでしょう。 mouse cDNAを5'UTRから3'UTRまでごっそりPCRで入手して適当なプロモーター下で蛋白発現させてみるのも良いでしょう（人工的なkozac配列付けずに内在性の翻訳開始点から蛋白を作らせる）。

(無題) 削除/引用 No.2508-2 - 2008/12/16 (火) 11:36:21 - 歩兵 マウスとウサギでそこまで分子量が違うというのはかなり希なことだと思います。non specificを疑った方が良いのではないでしょうか。

種の違いと分子量の違い 削除/引用 No.2508-1 - 2008/12/16 (火) 10:06:02 - ンJ 基礎的な質問で申し訳ございません。 リン酸化蛋白を調べるためWestern blotをやっています。 マウスの筋組織を使っているのですが市販の抗体でマウス由来のものがありません。 ラビットの抗体で種交差でマウスに使えるので使用していますが、 分子量が10kDaほど違うところにバンドがでてしまいます。 このバンドで良いのか、Non Specificなのか悩んでいます。 種の違いによって分子量が変わる事はあるのでしょうか？ またその場合、どれくらいの差が許容範囲になるのでしょうか？ よろしくお願いします。

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