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(無題) 削除/引用 No.2500-14 - 2008/12/15 (月) 20:11:08 - genji ＞~さん ＞高生産させたい場合などには、in vivoの事象との相関はどうでもよくなります。 全ての実験が、in vivoの事象の解明を目的としている訳ではありませんので。 なるほど、そうですね。 ＞おおさん ＞加えた脂質の生理的な意義を見いだす実験のほか、 何か人口的に細胞を刺激したり、するような実験も あるのではないかと、、何か新規のケミカルで、 酵素との反応では効果がでているけど、極端 に細胞に入りにくいとか、、、、 ふと疑問に感じたことがあるのですが、外から加えた脂質って細胞内に入ってからシグナルが伝達するものなのでしょうか？ ＞初心者さま 薬剤はDMSOかDMFに溶けてますよね。 溶媒を飛ばすというのはもしやEtOHに溶けているとか？ ストックはx100ぐらいを作っておいて、ちょい溶けにくかったら超音波抽出。 作り直した方が早いかもしれませんね。 他はみなさまと同じ意見です。

(無題) 削除/引用 No.2500-13 - 2008/12/15 (月) 17:01:16 - おお 細胞が吸収して適切な濃度になっているのに 細胞が反応しないのか、などいろいろ考えながら 実験を進める方がいいですね。 まずは論文と全く同様の実験をして(細胞も同じもの) 再現性とれるか見た方がいいかもしれません。 でそれでも再現性がとれないのなら、論文のデーター は安定して再現性がとれる実験ではないかもしれません。 その時点であえて、それでも続けるかどうか判断 しないといけないかもしれませんね。 あえて違う細胞でやっている理由がありますか?

(無題) 削除/引用 No.2500-12 - 2008/12/15 (月) 15:58:29 - ~ >論文などで既に報告されているような結果 まずは、論文と同じ細胞、試薬、条件を用いて確認実験を行うのが先だと思いますが。 >細胞が違うので 細胞の問題なのか、操作の問題なのかも分からないまま、濃度をあげてみるというのは、泥沼にはまる危険性がありますが… >キャリアとしてＢＳＡか血清を使用する場合には、薬剤をキャリアにそのまま溶解 それで添加はできます。 >何かで一回ストックの溶媒を飛ばす 添加する薬品が安定で、ストック用の溶媒が細胞に大きな影響を与えるのであれば、こちらのほうがいいですね。 >方法も教えていただくか、調べる方法を教えていただく 参考にしている論文で使われている方法と同じ方法をとることをお勧めします。 そのストック用の溶媒に溶けた試薬を、参考にしている論文でも使っているのであれば、 添加方法もそれに従っておけば、同じ結果が期待できるでしょう。 >[Re:9] genjiさんは書きました : > vivoで起きている事象を反映しているのか？という問題です。 高生産させたい場合などには、in vivoの事象との相関はどうでもよくなります。 全ての実験が、in vivoの事象の解明を目的としている訳ではありませんので。

返事が遅くなりました 削除/引用 No.2500-11 - 2008/12/15 (月) 15:18:48 - 初心者 皆様、色々なご意見ありがとうございます。 少し、誤解を招くような質問の仕方でしたので、再度詳しく書きます。 私の実験系は、浮遊細胞に脂質を添加して、mRNAの変化やproteinの変化などを確認しています。 薬剤のストックが既に非水溶性のものが溶媒となっているので、最初は適用濃度が小さいために、そのまま培地に添加していました。 しかし、予備実験の段階で、予想される結果、つまり論文などで既に報告されているような結果が得られないでいます。 「効果がない」に関しては、「予想される結果が得られない」という意味です。 細胞が違うので、濃度を大きくして確認してみようと思い、今回の質問に至りました。 少し確認したいのですが、キャリアとしてＢＳＡか血清を使用する場合には、薬剤をキャリアにそのまま溶解させて、濃度調整して添加すればいいのでしょうか？ それとも、何かで一回ストックの溶媒を飛ばす必要があるのでしょうか？ もしそうであれば、方法も教えていただくか、調べる方法を教えていただくとありがたいです。

(無題) 削除/引用 No.2500-10 - 2008/12/15 (月) 13:15:07 - おお >[Re:9] genjiさんは書きました : > vivoで起きている事象を反映しているのか？という問題です。 加えた脂質の生理的な意義を見いだす実験のほか、 何か人口的に細胞を刺激したり、するような実験も あるのではないかと、、何か新規のケミカルで、 酵素との反応では効果がでているけど、極端 に細胞に入りにくいとか、、、、

(無題) 削除/引用 No.2500-9 - 2008/12/15 (月) 12:08:54 - genji 十分承知しています。 逆に質問なのですが、その上のオーダー（high dose)で見た場合、それはvivoでの評価に繋がるようなデータであるといえるのでしょうか？ vivoで起きている事象を反映しているのか？という問題です。 とりあえず、外野の意見はどうでもいいので、初心者さんの実験系を詳しく聞きたいですね。

(無題) 削除/引用 No.2500-8 - 2008/12/15 (月) 10:33:49 - ~ もちろん、脂質が溶ける濃度で実験できるのであれば、キャリアは要りませんよ。 その上の濃度を添加したい時の話です。 脂質要求性の株の研究で、脂質を除いたアルブミンや血清を使っている報告もあります。 使っている細胞が無血清状態で必要な期間培養できないのであれば、それらが役に立つかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.2500-7 - 2008/12/14 (日) 18:27:39 - genji ホスファチジルイノシトールとかスフィンゴミエリンなど、普通にFBS入り培地に適量加えて実験していましたが、問題ありませんでした。 VSMCを使ってシグナル伝達を見たときはnMオーダーでいけました。 uMオーダーだと細胞が死んでしまいます。 特にキャリアーを使う必要はないと思います。 応えられる範囲でよろしいのですが、培養細胞と薬剤は何を使っていますか？ ~さまのおっしゃる通り、そもそも効果がある根拠はなんなのかというのは私も知りたいですね。

(無題) 削除/引用 No.2500-6 - 2008/12/14 (日) 17:56:37 - 人事労務 それはとても簡単なことです。 脂質のキャリアーとしてＢＳＡを使いますよね。 ＢＳＡ、つまりアルブミンを「無くせば」いいんです。 たとえば、培養細胞にであれば、ウシ血清などのＦＣＳを抜けばいいんです。 簡単でしょう。 特にＰＢＳなどで細胞を厳しく洗う必要はありません。 血清入りの培養用メディウムをaspirateしたあと、そこに脂質をserum free (alb free)の培地に溶かしたものを加えればいいんです。 ここで、もうひとつポイントです。 その脂質ですが、eppen tubeで溶かさないこと。 壁面にくっついちゃって再溶解されません。 そのため、有機溶媒に入ってる脂質をガラスバイアルに分けて、有機溶媒を飛ばした後、５０℃くらいであたためながら血清のない培地をバイアルに入れてボルテックスです。 あとはこの溶液をaspirateした細胞に直接加えるだけ。 僕は３７度、３時間取り込ませたあと、FACS検出しています。 ただ、どうしてもこの実験系はtrickyです。 ポイントは、脂質を取り込ませたいのであれば、キャリアー（この場合、ＢＳＡや血清アルブミン）を除けばいいんです☆（決まった…^^）

人事労務さん 削除/引用 No.2500-5 - 2008/12/14 (日) 17:39:37 - fish のっかりの質問で申し分けないのですが、 confidentialでなければ、キャリアーなしの方法を是非教えて頂きたいのですが。 論文などあればご教示いただけますか？ ある病態学の分野では、脂質が悪者として、培養細胞に多く添加されています。しかし、皆様がおっしゃられるようにキャリヤーを用いた方法では、実際に取り込まれているのか、膜内部にアンカーされているのか、膜表面上にぺたぺたくっついているのかなど、実際の状態がはっきりせずかなり微妙な系ではないかと感じてます。

(無題) 削除/引用 No.2500-4 - 2008/12/14 (日) 15:21:20 - 人事労務 私は某脂質をキャリアーなしで培養細胞に添加しています。 通常のやり方では細胞に取り込まれません。 しかし、私のやり方で簡単に取り込まれます。 簡単なことです。 たしかに、ＢＳＡは脂質のキャリアーとして使われます。 しかし、〜さんのおっしゃられている通り培地には溶けるが細胞に吸収されるとはまた違った話です。 おおさんのおっしゃられるリポソーム法はlipofectionの際に引き起こされるようなtoxicityの可能性は排除できません。死ぬ場合もおおいです。 私は細胞に取り込まれたかを、その脂質specificなモノクロを使ってFACS検出しています。 ５−２０uMで十分取り込まれます。 参考までに。

そもそも効果がある根拠はあるのでしょうか？ 削除/引用 No.2500-3 - 2008/12/14 (日) 11:29:20 - ~ 油滴が浮かんでも、しばらく攪拌すると溶ける場合はあります。 細胞にもよるかもしれませんが、使えるキャリアとしては、 おお さんの書かれているBSAのほかに シクロデキストリン デキストリン Tween 20など Pluronic F68 などもあります。 ただ、培地中に溶け込むことと、細胞に吸収されるのは別の話です。 蛍光物質やRIで標識して、細胞に取り込まれたかなどを見る必要があるかもしれません。 他の問題としては、そんなキャリアを使わなければいけない濃度での作用は、 in vivoでの作用とはかけ離れているかもしれないと言うことでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.2500-2 - 2008/12/14 (日) 11:23:30 - おお はっきり言って脂質を浮くほど加えたことがありませんので 実際の解決方法として適切かどうか分からないのですが、、 BSAなど脂質のキャリアーになるものとプレインキュベーション するとか、、、 あとはリポソームをリン脂質などともに作らせるくらいでしょうか

脂質を使用したin vitro実験系 削除/引用 No.2500-1 - 2008/12/14 (日) 11:15:38 - 初心者 いつも拝見しています。 最近実験を始めましたが、初心者のため色々と失敗を繰り返しています。 少し前から、脂質を培養細胞に作用させて反応を見るという実験を始めていますが、どうしてもうまくいきません。 その薬剤の効果が全く見られないのです。 薬剤は脂質なので、当然水には溶けないので、低濃度になるように培地に少量加えるようにはしているのですが、濃度が薄いのかとも考えています。 最終濃度を上げたいのですが、どのように水（培地）に溶けるような処理をすればいいのでしょうか？ 濃度を濃くしようと、脂質をそのまま加えると、大方の予想通り、浮いてきてしまいます。 もしご存知の方は教えてください。

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