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消化管上皮細胞のサンプリング トピック削除
No.2485-TOPIC - 2008/12/12 (金) 00:20:56 - TS
ラットやマウスを用いる動物試験で、ImmunoblottingやqPCRのための消化管上皮細胞のサンプリングについての質問です。みなさんが気にしているTipsなどを教えてもらえたらと思っています。

消化管機能研究において、消化管上皮細胞を回収して、IBやqPCRを行うことは多いと思います。しかしながら、消化管は上皮細胞層、粘膜下層、筋層などといった異なる細胞群で構成されており、さらには絨毛、クリプトといった分化ステージの異なる細胞群も混在しています。

このような実態の中で、IBやqPCRを行い、タンパク質の発現量や局在を評価する際には、そのサンプリング条件を一定にするために、細心の注意を払う必要があると思います。一般的な手法としては、スライドガラスでスクレイプしてサンプリングすることが多いと思いますが、みなさんはどのようなところにこだわって行っていますか？

私が思いつくところとしては、
1.できる限り上皮細胞のみを採取できるように一定の力を負荷して、スクレイプする。（おそらくこの場合にきれいにとれるかどうかは、慣れと技量に依存すると思います）
2.1.は口で言うほど簡単ではないので、漿膜のみを残す気持ちで、筋層までを根こそぎスクレイプして、サンプリング条件を一定にする。

どちらが好ましいといえるのでしょうか？
もちろん、EDTAなどを用いて、上皮細胞を採取する方法や、免疫染色を用いて評価する方法もあると思いますが、その点にはあまりふれないで議論したいと思っています。もしくは、１と２以外に、サンプリング条件を一定にできる方法があれば、それも教えてもらえればと思います。
　
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buy valium 削除/引用
No.2485-7 - 2009/06/06 (土) 22:43:08 - HsvsRsvsesv
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(無題) 削除/引用
No.2485-6 - 2009/01/16 (金) 20:26:46 - chrom
FACS使ってやってます。

(無題) 削除/引用
No.2485-5 - 2009/01/16 (金) 15:49:22 - O
私は子宮を扱っているのですが、似たような管腔形態の臓器ですからあるいは参考になるかも知れません。

マウスやラットから子宮上皮を回収する際には、両端を切り落として筒状にした子宮を反転し（管腔上皮が外側に来ます）、コラゲナーゼor dispaseなど基底膜消化作用のある酵素液に浸けて３７度で３０分ほど反応させた後に軽く揺すると上皮がシート状に剥がれてきます。

もし反転が難しければ（しかし、消化管は子宮より反転は楽なはずです）、管腔の片端をクランプし、中に酵素液を入れ、もう一端もクランプして放置。その後、クランプを外してPBS等を数回通してやれば、同様に上皮シートが取れます。
消化管でも使用できる手技では？参考になればいいのですが。

少し付け加えます 削除/引用
No.2485-4 - 2008/12/12 (金) 22:29:00 - TS
よっしーさん、うーんさん、ありがとうございます。

少し私の言葉足らずの部分があったかもしれないので、もう少し付け加えさせていただきます。今回の実験でやりたいことは、薬剤を投与したラットから消化管上皮細胞をとってきて、目的のタンパク質がどの程度、核や細胞膜に移行するのかを検討したいのです。つまり、サンプリング後に細胞小器官の分画をし、IBによって定量することで、対照群と薬剤投与群との差を見たいというものです。そこで、スライドグラスによって粘膜をはぎ取るという手法でやりたいのですが、このときスライドグラスによる掻き取り具合（筋層や粘膜下層のコンタミの程度）が、サンプルごとにまちまちになってしまいますので、それをどのように標準化して、一定に行えるかを考えているのです。コンタミは仕方ないと思っているのですが、その程度を一定にしたいということです。それでこのような質問を上げさせてもらっています。

ETDAで剥離し、上皮細胞のみをパーコールで分離することは、もちろんできるのですが、それでは解剖時の細胞の状況を反映できません。

LCMは考えてはいませんでしたが、固定操作が入りますし、やはり今回の目的には合わないのではと思っています。それにLCMって、IBできるほどのタンパク量がとれるものなのですか？　なんとなくPCRくらいしかできないような気がしていたんですけど。

最初にも言いましたが、免疫染色も定量性に欠けるので、まずはIBを考えているのです。

いかがでしょうか？

(無題) 削除/引用
No.2485-3 - 2008/12/12 (金) 10:53:18 - よっしー
学生時代の話なのでうる覚えですが，
腸管を反転させて(筋層を内向き，絨毛を外向き)
培地かなんかで振盪させて，ガラスウールでろ過して，
パーコール25%と40%の界面が上皮細胞，
40%と75%の界面がIELだったような気がします．
かなり綺麗に分離できたと思います．
LCMと比べると，汚いと思いますが・・・．
IELの単離の仕方と同じ方法です．
参考になれば・・・．

(無題) 削除/引用
No.2485-2 - 2008/12/12 (金) 07:36:53 - うーん
消化管上皮の初代培養って難しいですよね。
今回は培養するわけではないんですね。

僕だったらlaser capture microdisection (LCM)を使って目的の細胞だけを飛ばします。

同じような状況で、小脳のプルキンエ細胞のみを採取してRNAを取ってるひとがいたものですから。参考までに。

というか、EDTAで剥離できます？？

消化管上皮細胞のサンプリング 削除/引用
No.2485-1 - 2008/12/12 (金) 00:20:56 - TS
ラットやマウスを用いる動物試験で、ImmunoblottingやqPCRのための消化管上皮細胞のサンプリングについての質問です。みなさんが気にしているTipsなどを教えてもらえたらと思っています。

消化管機能研究において、消化管上皮細胞を回収して、IBやqPCRを行うことは多いと思います。しかしながら、消化管は上皮細胞層、粘膜下層、筋層などといった異なる細胞群で構成されており、さらには絨毛、クリプトといった分化ステージの異なる細胞群も混在しています。

このような実態の中で、IBやqPCRを行い、タンパク質の発現量や局在を評価する際には、そのサンプリング条件を一定にするために、細心の注意を払う必要があると思います。一般的な手法としては、スライドガラスでスクレイプしてサンプリングすることが多いと思いますが、みなさんはどのようなところにこだわって行っていますか？

私が思いつくところとしては、
1.できる限り上皮細胞のみを採取できるように一定の力を負荷して、スクレイプする。（おそらくこの場合にきれいにとれるかどうかは、慣れと技量に依存すると思います）
2.1.は口で言うほど簡単ではないので、漿膜のみを残す気持ちで、筋層までを根こそぎスクレイプして、サンプリング条件を一定にする。

どちらが好ましいといえるのでしょうか？
もちろん、EDTAなどを用いて、上皮細胞を採取する方法や、免疫染色を用いて評価する方法もあると思いますが、その点にはあまりふれないで議論したいと思っています。もしくは、１と２以外に、サンプリング条件を一定にできる方法があれば、それも教えてもらえればと思います。
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