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(無題) 削除/引用 No.2477-5 - 2008/12/16 (火) 17:16:52 - AP >クローニングするのであれば、末端が削れているかどうかを調べるために複数クローンをチェックするのは非効率的です。 というより、末端が削れてしまうとligation効率が下がってしまいプラスミドに入りにくくなるのが問題ですね。3' exonuclease活性で3'陥没を生じてしまうので、平滑ライゲーションにしても、プライマー末端にデザインした制限酵素サイトで切るにしても不都合です。

(無題) 削除/引用 No.2477-4 - 2008/12/14 (日) 23:43:57 - 佐山あやこ 通りすがりさん 常温程度だと一晩で nuclease活性が強くてPCR産物が分解されてゲルで流しても 全く見えなくなった経験がありますね。 一晩ですか！？ やはり−20 ℃保存ですね。 経験に基づく貴重なご意見あるがとうございます。 ~さん 私ならサーマルサイクラー上で一晩過ごすなら4度以下、 PCR終了後までいるのであれば、冷凍で保存するように指示します。にするためのコストよりも、複数クローンの末端をチェックする方がコストがかかると思います。 ご尤もです・・・ 時間、お金どちらのコストを考えても末端チェックより冷凍保存です。

使用目的にもよるのでしょうけれども 削除/引用 No.2477-3 - 2008/12/11 (木) 09:42:19 - ~ Sigma社のtaq polymerase(一番安いやつ)では、一晩室温でもバンドが見えなくなるようなことはありませんでした。 ただ、そこからバンドを回収してクローニングしたことはありません。 クローニングするのであれば、末端が削れているかどうかを調べるために複数クローンをチェックするのは非効率的です。 サーマルサイクラー上で一晩4℃にするためのコストよりも、複数クローンの末端をチェックする方がコストがかかると思います。 私ならサーマルサイクラー上で一晩過ごすなら4度以下、 PCR終了後までいるのであれば、冷凍で保存するように指示します。

(無題) 削除/引用 No.2477-2 - 2008/12/10 (水) 18:46:08 - 通りすがり PCRに使ったTaqとかの酵素の種類に依存するのですが, 常温程度だと一晩で nuclease活性が強くてPCR産物が分解されてゲルで流しても 全く見えなくなった経験がありますね。 あとPCR後サーマルサイクラーに４度∞でおいて 一晩ぐらいでやはり分解してしまう酵素もたしかalpha型の中であったはず(datasheetにも注意書きで書いてあったはずです) なので あんまり自分は４度でも常温でも保管しないです。 すぐ精製するか-20度とかで保存したほうがいいでしょう。

ＰＣＲ産物は常温で何日保存可能か？ 削除/引用 No.2477-1 - 2008/12/10 (水) 17:55:25 - 佐山あやこ ＰＣＲ産物ですが、常温で何日くらいなら、分解されず保存可能でしょうか？

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