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まず基本的な勉強からして下さい。 削除/引用 No.243-10 - 2007/09/27 (木) 11:53:36 - mom 手元に適当なものがないので具体例を挙げることができませんが、まずは電気泳動の手技・原理などが書かれている本をよく読んでから始められる方が良いと思います。 ＞マーカーの先端が中程にあるときにサンプルの先端が下端にたどりついてしまって。。 「サンプル」とおっしゃっていますが、ゲルの下端まで泳動されているのはBPBのことですね。BPBはタンパクよりもずっと速く泳動されますから、マーカーやサンプル（タンパク）がゲルの中程（どの程度の位置にあるかはサイズによりますが）にあるうちに下端までたどりつきます。というか、だからこそBPBが目印になるわけで…。 ＞実際CBB染色するとタンパク質は分子量ごとに分かれていました。 バンドがシャープに見えていますか？どういったマーカーを使っておられるのかわかりませんが、市販のマーカーでしたら泳動写真がdata sheetやHPで確認できると思いますが、比べてみてどうですか？問題なければ、泳動操作自体は上手く行っていたということでしょう。（そして、マーカーにも問題なし。） 分子量30〜40kDaをもっと広く泳動したいということですが、今は何％のゲルを作っているのでしょうか？目的とするタンパクの大きさによってゲル濃度を変える必要があります。この辺も、基本的な実験書に書かれているものを参考にして下さい。 最後に、 ＞サンプルのラインがゲルからはみ出した後も泳動を続けてみようかとも思ったのですが，その場合，何か問題はあるのでしょうか？ 「BPB」がゲルから落ちた後に泳動を続けても特に問題はありませんが、サンプルがどこまで泳動されているかわかりませんから、流しすぎるとサンプルもゲルから落っこちてしまうという危険があります。ただ、ここではマーカーがプレステインもののようですから、マーカーの移動度を目安にすることが出来ると思います。ただし、これは問題の解決にならないと思います。

(無題) 削除/引用 No.243-9 - 2007/09/27 (木) 10:06:24 - みぃ 分子量の範囲30から40です。。

(無題) 削除/引用 No.243-8 - 2007/09/27 (木) 10:05:23 - みぃ ＞ssさん もう一度試薬の調整からやってみたいと思います！ ＞ ~さん ＞プレステインのマーカーは泳動先端よりも移動速度が遅いため、途中までしか進んでいないのは普通のことかと思います 常識なのでしょうか，知りませんでした・・・。 ラインがぼやけるというのは，BPBだけ見た話でした。 実際CBB染色するとタンパク質は分子量ごとに分かれていました。 ただ，見たい分子量の範囲(30〜40kD)をもっと大きく(広く？)泳動したいのですが，マーカーの先端が中程にあるときにサンプルの先端が下端にたどりついてしまって。。 中程でサンプルがぼやけるのが原因かなと思っていました。 マーカーは凍結融解繰り返してるので，新しいマーカーで再度泳動してみたいと思います！

(無題) 削除/引用 No.243-7 - 2007/09/26 (水) 12:59:24 - ~ マーカーと、分子量既知のサンプルを複数流してみてはいかがでしょう？ 凍結融解を繰り返したマーカーが悪くなっているのかもしれません。 たとえば、融解後、よく混和しなかったので、薄い/濃いバッファーに溶けているマーカーを使っているのかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.243-6 - 2007/09/26 (水) 12:53:32 - ~ >ゲルの濃度の問題なのでしょうか？それともサンプル作成時の問題なのでしょうか・・・？ そもそも、問題が起きているのですか？ サンプルのラインというのは泳動先端(loading buffer中のBPB)のことですよね。 拡散してぼやけるというのもBPBについてのみ見ているのでしょうか。 実際のたんぱく質の泳動をCBBなどで見ていないのでしょうか？ >サンプルが下端まで流れてもマーカーのラインは中程で止まっています。 プレステインのマーカーは泳動先端よりも移動速度が遅いため、途中までしか進んでいないのは普通のことかと思いますが、 中程に、複数のマーカーのバンドがたまっているのですか？ それとも、いろいろな泳動時間でCBBで染色したときに、ゲルの中央部分までしかたんぱく質(とマーカー)が進まず、 泳動時間を長くしてもそれが進まないということですか？

(無題) 削除/引用 No.243-5 - 2007/09/26 (水) 11:42:03 - ss 中程までいくと電圧があがるのですね。ランニングバッファーが薄すぎると そうなりますね。使い回してると濃縮もかなり悪くなります。

(無題) 削除/引用 No.243-4 - 2007/09/26 (水) 11:40:10 - ss こういう場合は、あれかなこれかな一つずつ変えていくより、自分で全てを 作り直すのが最速だと思います。ほぼ間違いなく、試薬の質、組成やpHに 問題があるのでpHメーターさえ疑って是非作り直して下さい。

(無題) 削除/引用 No.243-3 - 2007/09/26 (水) 11:11:45 - みぃ ＞ytさん ランニングバッファーはゲルが浸るように十分入れています・・・。 泳動のラインが問題の中程に来ると，電圧が上がり気味になります。

(無題) 削除/引用 No.243-2 - 2007/09/25 (火) 23:02:26 - yt Did you use enough amount of running buffer?

SDS-PAGEがうまくできません・・・ 削除/引用 No.243-1 - 2007/09/25 (火) 17:42:33 - みぃ 周りに質問できる方がいなくて困っていました。解決策御存知の方いらっしゃいましたら，ご回答よろしくお願いします！ SDS-PAGEでサンプルを流すと，stacking gelの部分はきれいに泳動してくれるのですが，ゲルの中程までいくとサンプルが拡散したようにぼやけてしまいます。引き続き流すと，下端ではきれいに一直線になってくれるのですが・・・。 一方，マーカーは中程までいくと流れにくくなるのか，サンプルが下端まで流れてもマーカーのラインは中程で止まっています。 ゲルは自分で作っていますが，pHや組成は問題無いようでした。 バッファーは既製品を使用しています。 ゲルの濃度の問題なのでしょうか？それともサンプル作成時の問題なのでしょうか・・・？ それと，なかなかマーカーが流れないので，サンプルのラインがゲルからはみ出した後も泳動を続けてみようかとも思ったのですが，その場合，何か問題はあるのでしょうか？まぬけな質問でスミマセン・・・。

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