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参考まで 削除/引用 No.234-10 - 2007/10/06 (土) 19:34:59 - taka 効率はそれほど良くなかったと思いますがリポフェクトアミンLTXでsiRNAによるノックダウンは確認できました。接着系なので一般的なリポフェクションで、かなり入ると思います。 stableを得るには40-50個拾わないと1個も取れないことはまあまああります（細胞種にもよりますが）。 環状のままでも可能ですが、下の方がコメントされていた通りです。

(無題) 削除/引用 No.234-9 - 2007/10/02 (火) 05:22:49 - ぽすどく レトロで普通に作れました。コロニーピックアップはしてないのでバルクの状態ですが、Ｗｅｓｔｅｒｎで確認済み。

(無題) 削除/引用 No.234-8 - 2007/09/26 (水) 04:10:57 - RAW264.7 私はアデノウイルス、Lipofectamin Plusを使った経験があります。 少し話が逸れますが、Contorol用にGFPを入れたベクターを準備したのですが、蛍光が全く見れませんでした。にもかかわらず目的遺伝子の発現が（GFP Controlでも）上がっていました。RAWをよく使っている知り合いに話をしたところ、RAWは結構sensitiveなところがあって、いくつかの遺伝子は係代の為に（少し強めに）セルスクレイパーで引っかいても誘導されるし、コンフルエンシーが少し（80%を超えたくらい）上がっても誘導されるし、などと取り扱いに注意が必要な細胞であることを教えてくれました。調べたい遺伝子がトランスフェクションの作業自体によっても誘導されたりしないかにも注意する必要があるかと思っています。

(無題) 削除/引用 No.234-7 - 2007/09/25 (火) 17:28:28 - T-2 私も以前この細胞を使っていました。 確かにリポフェクションが困難だった記憶があります。 初心者さん、RAW264.7さんはどのような 試薬を使われいるのでしょうか？ 今はFuGENE HDというのが出ているみたいです。 使ったことは無いのですが、説明にはRAW細胞にも入るとあります。 stableをとるならこれとIRESシステムで何とかなるかもしれません。 だめならモノクロさんがおっしゃる通り、 エレポが一番いいのかもしれませんね。

(無題) 削除/引用 No.234-6 - 2007/09/25 (火) 16:16:38 - モノクロ RAW264.7トランスフェクタントに関する論文は結構あるようですね。 そのうちの一報を添付しておきます。 Functional Expression of Nramp1 In Vitro in the Murine Macrophage Line RAW264.7 Infection and Immunity, May 1999, p. 2225-2232, Vol. 67, No. 5 ２報ほどざっと読み流しましたが、双方ともエレクトロポーレーションで導入してました。リポフェクトアミン等では導入しづらいのかもしれませんね。 一過性発現でシグナルが検出できないのならば、相当数のクローンを解析しないとstableは取れないと思います。 従って、一過性発現でシグナルが検出できる遺伝子導入ツール（Fugene,エレポ，GenomeOne?)を探すほうが近道かと思います。 もしくはＦＡＣＳがあればソーティングによりクローンを取得出来ると思いますが、ストレスに耐えられるかはわかりません。 以上、ご参考まで

横から 削除/引用 No.234-5 - 2007/09/24 (月) 09:58:09 - RAW264.7 私もRAW264.7を使っていますが、この細胞へのexpression vectorやアデノウイルスなどを使っての強制発現は可能なのでしょうか？私もうまくいかなかった覚えがあります。もしもRAW cellsへの強制発現を行っている文献をお知りでしたら教えていただけないでしょうか？

IRES 削除/引用 No.234-4 - 2007/09/23 (日) 21:23:01 - ats IRESについて補足します。 多用されているIRESはウィルス由来がほとんどで、特徴的なRNA高次構造を形成し、細胞内タンパクと相互作用します。 そのため組織によってその翻訳促進効果に差があったと思います。 ほとんどの細胞は問題なく使用できるはずですが、免疫系細胞に使えるかどうか自信がありません。 ご使用前にメーカーに問い合わせるか文献で検討してください。 中途半端なコメントですいません。

(無題) 削除/引用 No.234-3 - 2007/09/23 (日) 05:03:46 - 初心者 ありがとうございます。 IRESというのは始めて知りました。購入を検討します。 免疫系細胞ではウィルスを使った遺伝子導入は嫌がられることがあるという話を聞いたことがあるので、プラスミドベクターで行っているのですが。。。

(無題) 削除/引用 No.234-2 - 2007/09/22 (土) 16:00:23 - ats 環状のまま導入すると、染色体DNAに組み込まれるときランダムに切断されることとなり、目的遺伝子の発現ユニットが切断される（発現しない）確率も高くなります。ベクタ−を切断して直鎖状にする理由は、多少とも目的遺伝子の発現ユニットが切断される可能性を減らすためです。 安定発現株を取るために、私は目的遺伝子と薬剤耐性遺伝子が同じｍRNAから翻訳されるようにIRESを使ったコンストラクト（かつ、組込み効率が高いretrovirus ( or lentivirus)）を使っています。この場合は全ての薬剤耐性細胞で目的遺伝子の発現が保証されるのでクロ−ン化しなくても済みます。 発現細胞をクロ−ン化すると、目的遺伝子と関係ないそのクロ−ン特有の性質のせいで、originalの細胞集団の性質と異なることがあります。見つけやすい変化は形態や増殖速度が異なることです。また目的遺伝子が組み込まれた部位・数による影響も考慮する必要があります。 そのため、最低でも３クロ−ンほど使用してassayすることをお勧めします。 こんなことが面倒なので、IRESを利用し、実験目的に合えばクロ−ン化しないで50コロニ−以上のMix細胞集団を使用することをお勧めします。

RAW 264.7を用いた安定発現株 stable cell lineの作成について 削除/引用 No.234-1 - 2007/09/22 (土) 11:47:38 - 初心者 初めまして。 pcDNA-flag vectorを用いて、目的タンパクを安定して発現する細胞株を得ようとしています。 Geneticin 0.4 mg/lで3週間程度セレクションを行い、コロニーをピックアップしてFlag抗体でIBを行いました。 15 clone程度を試しましたが、いまだに1つも目的タンパク質を発現する細胞が得られません。 初めてなもので、どの程度の確立で安定発現株が得られるのか分からないのですが、HEK293を用いている同僚はHEKでは20%程度は得られたという話でした。（ちなみに私が使っているのはRAW 264.7です） これはRAW 264.7細胞では安定細胞株を得るのが難しいためなのか、疑問に思っています。 細胞毒性についても考えましたが、他の細胞種ではそのような作用もなく、また、RAW264.7に発現を試みている数種類のタンパク質すべてについて、うまくいかない状況なので、他に原因があると考えています。 よくプロトコールにはベクターを導入する際に環状を切断して導入すると書いてありますが、本によってはそれほど大きくないベクターに関しては切断する必要はない、ともありましたので、今回は切断をせずに使用しています。これが原因になることがあるのでしょうか？ 経験がないもので困っています。 よろしくお願いいたします、

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