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現在の新着状況 削除/引用 No.2268-15 - 2008/12/12 (金) 09:15:47 - mugimaki 皆様色々とアドバイス等ありがとうございました． 報告が遅くなりましたが，現在の状況を報告させていただきます． 自作したprimerの結果を検証するため，既存のprimerを用いて 18Sの発現を検討したところ，ほぼ同等のCt値を得ることが出来ましたので real time PCRはそんなにひどい結果ではないのだろうと考え，こちらで 検討をしていこうと思います． 何人かの方が指摘されておられますように定量性が問題になるようにも 思いますので，希釈した系で定量性を確認しました． 文献を色々検討しましたが， 18Sはpre-rRNAから作られ，pre-rRNAは発現量が色々な細胞の状態に よって変動する（考えてみたら当然のような気もしますが）という興味深い いくつかの論文にも出会うことが出来ました． 通常のmRNAと異なり，転写とかゲノム構造とか理解しにくい面もありますが， 面白かったです．色々な場所にprimerを設計し，こちらも時間とお金と体力が あれば見ていけたらなぁと思いました． 引き続き実験は慎重に検討して進めようと思います． 皆様ありがとうございました． PS どうして18Sをinternal controlに使用するか何か ご存じの方いらっしゃいましたらコメント宜しくお願いいたします． 5.7Sとか28Sとかでもいいような気がしたもので．．．

＞ザンギさん 削除/引用 No.2268-14 - 2008/11/17 (月) 20:41:32 - mom-a ありがとうございます。 mixしたプライマーが売られているのですね。調べてみます。

(無題) 削除/引用 No.2268-13 - 2008/11/14 (金) 14:50:29 - ザンギ >[Re:12] mom-aさんは書きました : > トピ主さんの本来の質問とずれてしまって申し訳ありませんが > > >ランダムヘキサマーとオリゴdTプライマーをミックスしたプライマー > > これって一般的な方法なのですか？私ははじめて見たので、利点などあれば教えて下さい。 > 遺伝子発現解析用に組んであるキットでは、これを使ってることがあります。 QiagenとかInvitrogenから出てますし、ほかにもあると思います。 メリットは、ｍRNA上でのPCRターゲットの位置に依存した逆転写効率のばらつきが抑えられることでしょう。 ３’末端に近い場合にはオリゴｄTから逆転写されますし、３’末端から遠い場合にはランダムオリゴでってことを狙ってると思います。

AMさんに質問なのですが 削除/引用 No.2268-12 - 2008/11/14 (金) 12:25:03 - mom-a トピ主さんの本来の質問とずれてしまって申し訳ありませんが >ランダムヘキサマーとオリゴdTプライマーをミックスしたプライマー これって一般的な方法なのですか？私ははじめて見たので、利点などあれば教えて下さい。 質問だけではなんなので、トピ主さんへ Ct値が1桁になると、濃すぎるというか検量線の直線性が悪くなってきます。テンプレートを原液で使うと検量線の端っこですから、気になることは気になるかもしれません。テンプレートに余裕があれば、一度倍量とかにしてみて、直線性のある上限（？）を確かめてみられてはどうでしょうか。原液のあたりから直線性が悪くなりはじめるようでしたら、希釈した方が良いように思いますが。直線性がよければ、濃いことを気にする必要はないでしょう。 ただ、トピ主さんが気にされているのは、あまりにも多量にあるrRNAと少量しかないターゲット遺伝子では逆転写効率に差ができないのか？ということのような気もしますが…。APさんから「random primerだからrRNAだろうがpolyA+RNAだろうが同じ確率で逆転写するでしょ？」というお答えがありますね。 （私はどちらかというと、逆転写効率が極端に悪い場合は発現量が極少量の遺伝子の方が影響を受ける気がしますが…）

(無題) 削除/引用 No.2268-11 - 2008/11/14 (金) 11:45:57 - AM Rさんと同感です。 標的遺伝子とinternal cont.のCt値の差が大きいと、相対定量のために割算するとCt値の小さいcont.方がほんの0.何サイクルずれただけで何倍も差が出てしまい標的遺伝子の発現量のデータがうまく数値化できなかったことがあります(βアクチンでしたが)。 同じcDNAの希釈倍率で測定できそうなinternal cont.を見つけるのがベストなのでしょうが見つからない場合は手ブレを覚悟して標的遺伝子と同じくらいのCt値になるよう希釈してしまったりしています。 あまりCt値が10サイクル前後くらいの高コピーだとPCR阻害かかるのか検量線の間隔もおかしくなる気がします。 また多少の手ブレがあったとしても同じくらいのCt値になるように調製したinternal controlが大きくぶれるのであれば別の遺伝子を探しています。 ただでさえ逆転写反応は効率がよくないので条件はなるだけ変えない方が良いと思います。ちなみに私はいつも遺伝子の発現定量を相対定量する時はOD値でそろえたトータルRNA量をランダムヘキサマーとオリゴdTプライマーをミックスしたプライマーでなるだけ高温でかけられる逆転写酵素を使って行っています。 長文すみません･･･。

(無題) 削除/引用 No.2268-10 - 2008/11/14 (金) 09:43:25 - R 私はinternal cont.に18Sを使用していませんが、 通常の逆転写の条件ではprimerも酵素も過剰ですのでrRNAに対しても現在の条件で十分だと思います。 mugimakiさんの疑問は分かる気がします。 私もinternal cont.のCt値が5-6だと標的遺伝子のCt値と大きく外れるのでなんか気持ち悪いです。 あまりにもabundantなものをPosi. cont.ではなくてinternal cont.にするのって少し疑問に思います。

(無題) 削除/引用 No.2268-9 - 2008/11/13 (木) 23:10:21 - AP >私はいつもRandom primerでRTしております． >Olido-dTは使用しておりません． だとすると、質問の意図に全く論理的に整合性がなくて困惑してしまうのですが。 今までpolyA+ RNAをRT-PCRで検出していたときには同時にrRNAも同じようにr逆転写されていたのでしょう？　もし、rRNAの逆転写には不十分な条件だとしたら、polyA+ RNAにたいしても不十分であって不適当だったということになるでしょう？　randon primerならrRNAもpolyA+ RNAも確率的に区別しないと考えますが。

(無題) 削除/引用 No.2268-8 - 2008/11/13 (木) 20:38:54 - mugimaki AP様，ご覧頂いている方へ 必要な情報はすべて書き込んだと思っていたのですが， 大事なRTのprimerの情報が抜けておりました．大変申し訳ございません． 私はいつもRandom primerでRTしております． Olido-dTは使用しておりません． 宜しくお願いいたします．

(無題) 削除/引用 No.2268-6 - 2008/11/12 (水) 20:20:48 - AP 逆に聞きますが、18Sを使わないときはどのように逆転写をやっていたのですか。使っているのはtotal RNAですよね（polyA+にすると濃縮できるけれど、PCRで定量する場合不必要なだけでなく、バイアスがかかるのでやらない方がいい）。逆転写のプライマーはoligo-dT、random?(gene specificということはないですよね）。そういう情報なしに、今までの通りでいいか、何か変えた方がいいかと聞かれても答えにくいです。一般論としてはrRNAをターゲットとするからといって、逆転写の反応条件で変更すべき点はないです。 普通、逆転写は同じ系で、oligo-dTでもrandomでもどちらも使えるようになっています。反応スケールや反応時間を変える必要はありません。また定量PCRのためには、ターゲットがmRNAの場合でも、バイアスがかかりにくいrandom primerをあえて使うことも多いです（わたしはrandom派）。 なので、 >量のおおいrRNAのRTをより効率的に行うためにもRTの時間を >長くするなど工夫が必要なのかというのが主な疑問点です． randomプライマーを使っていたのならそのままで、oligo-dTだったのならrandomに変えてやるだけで他に変えるところはないと思います。

(無題) 削除/引用 No.2268-5 - 2008/11/12 (水) 19:48:15 - おお >[Re:4] mugimakiさんは書きました : >[Re:3] おおさんは書きました : > 可能性は否定しませんが、慎重に判断してください。 > 実験系としてそれが本当にいえているか、 > いえないけどその傾向がありそうなら、 > どういう実験系がべすとか、、、、、 > > rRNAなので、まずは翻訳が機能として > 挙げられると思います。そのほかについては > PUBMEDで調べられると言いかと、、、、 > 特にプロモーターの解析などが > わかり易いかもしれません。 あ、とぴ間違えて投稿してますね、、、、 おはずかしい、、、、

(無題) 削除/引用 No.2268-4 - 2008/11/12 (水) 19:40:13 - mugimaki AP様，おお様お忙しい中コメントして頂き本当にありがとうございます． 個人的にはお二方のご意見を伺いたかったので嬉しいです． さて， >RT反応について 私も内部コントロール用とターゲット用を別々の系で逆転写するのは， 内部標準としての意味が薄れるので意味があるとは思っていません． なので，あくまで同一の系で行おうとは思っているのですが， 量のおおいrRNAのRTをより効率的に行うためにもRTの時間を 長くするなど工夫が必要なのかというのが主な疑問点です． >rRNAに関して 実験結果については，確かに慎重な検討が必要と思われますので， 他の論文を参考にして判断したいと思います．他のprimerで実験を してみようと思います． rRNAについて現在文献，databaseを検討し，色々調べております． 以前のトピにもmRNAと比べて遙かに多い18Sが内部標準として 適当かという議論もありましたが，本当の意味での内部標準は 無いと思うので，どこかで総合的に決めなければなりませんよね． 慎重に実験を続けて行こうと思います． 引き続き「色々な」ご意見アドバイス募集します． 特に18Sを内部標準として使用している方やrRNAの研究を されている方がいらっしゃいましたら，お忙しいところ 恐縮ですがコメントを宜しくお願いいたします．

(無題) 削除/引用 No.2268-3 - 2008/11/12 (水) 08:43:03 - おお 可能性は否定しませんが、慎重に判断してください。 実験系としてそれが本当にいえているか、 いえないけどその傾向がありそうなら、 どういう実験系がべすとか、、、、、 rRNAなので、まずは翻訳が機能として 挙げられると思います。そのほかについては PUBMEDで調べられると言いかと、、、、 特にプロモーターの解析などが わかり易いかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.2268-2 - 2008/11/10 (月) 21:44:56 - AP >こんなに高い値なのでしょうか． total RNAのうちmRNAは1-2%、そのパイを、いろいろな遺伝子（一万種以上？）からのmRNAで分け合っています。 http://www.kenkyuu.net/cgi-biotech2/biotechforum.cgi?mode=view;Code=2233 残りの98-99%はほとんどrRNAと考えて良いです（多くの精製法では、tRNAはとれてこないので）。試算はしていませんが、それを考えればおかしくないと思いますがどうでしょう。試算してCt値と考え合わせてみてください。 >その際，テンプレートのcDNAを希釈したりしていらっしゃるのでしょうか． 定量性のあるデータがきれいにとれるなら、濃くても希釈してもいいのでは。 >1. 逆転写反応について >　　　RNAの量を減らす，反応時間を長くする，酵素の量を増やすなど， >　　　通常のmRNAのRTとは異なった方法でやってますか？ 違う流儀があるのかもしれませんが、内部コントロールとターゲットで逆転写の系を別にするのは通常しないです。そうでなくても、逆転写効率はtube-to-tubeで振れやすいです。同じRNAを使って、内部コントロール用とターゲット用を別々の系で逆転写する、さらに同じように比較対象のRNAも逆転写する、となると内部コントロールによるnormalizationが全く信用できません。 内部コントロールもターゲットも、random primerあるいはoligo-dT primerで一本のチューブで逆転写したcDNAプールから、PCRするべきだと思います（ターゲットによって投入する鋳型cDNAプールの適量が違うことは、あって当然）。

Real time PCRのinternal controlの18Sについて 削除/引用 No.2268-1 - 2008/11/07 (金) 22:30:54 - mugimaki いつも色々な情報を日々参考にさせて頂いております． Real time PCRでのinternal controlに18Sを用いて 日々実験しておられる方に，その詳細伺いたくトピを立てさせて頂きました． 当方は日頃より，A社の試薬を用いて逆転写後， Q社のSYBR Greenにてreal time PCRをしております． internal controlではGAPDH,actinなどを用いてきましたが， 18Sを使用したことはありません． 疑問点は以下の点です． 1. 逆転写反応について 　　　RNAの量を減らす，反応時間を長くする，酵素の量を増やすなど， 　　　通常のmRNAのRTとは異なった方法でやってますか？ 2. Real time PCRについて 　　　元データのCt値はどのくらいでしょうか．その際，テンプレートのcDNAを 　　　希釈したりしていらっしゃるのでしょうか． GAPDHや他の遺伝子と同じ方法で，real time PCRを行うと，18SのCt値が5-6くらいになります．（RNA 0.2ugを使用し，50ulの反応系でRTを行い,templateに1/10 ulを使用しています） 因みにprimerは自作です．増幅産物が18Sであることはsequenceで確認しています． dimerなどが出来ないことも電気泳動およびdissociation curveにて確認しています． 段階希釈し検量線を得ると，データは直線上で，定量性があるとは思われるのですが， こんなに高い値なのでしょうか． RNAのほとんどがrRNAという事を考えると当然のなのかもしれませんが， ちょっと気になっています． 非常に細かい話ですが，皆様どのように行っており，どのようなdataかを お忙しいところ誠に恐れ入りますが，お教え頂けると幸いです．

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