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オリゴ培養法について 削除/引用 No.2264-5 - 2009/01/23 (金) 09:39:22 - だい もう遅いかもしれませんが、情報をひとつ。 脂肪の塊はミエリンだと思うのですが、パーコールにかける前にこれを取り除くのがよいと思います。 酵素処理後に遠心して細胞を落とし、20%BSAが含まれるDMEMでけんだくし、1000xgで30minくらい回すとチューブ上部にミエリン層ができます。 これを取り除き、下の細胞塊をパーコールで分離してみてはいかがでしょうか？ また、実験医学 Vol.21 No.6 821- (2003, 4月号)に遠心分離を用いない方法が紹介されていますよ。

(無題) 削除/引用 No.2264-4 - 2008/11/18 (火) 11:44:49 - よっしー パーコールは比重によって分離しますので， 温度を変えると密度が変わり，分離パターンが変化します． 私の場合は24度で統一して条件検討などを行っていますので， 細胞を懸濁する時から24度のパーコールを用い，遠心も24度で行っています． ブレーキはせっかくきれいに分離できた界面を乱したくないので， ブレーキ無しで遠心しています． あと細かいことですが，界面の細胞を使う時は， 先に上層の液をチューブに入れ，細胞を懸濁した下層(パーコールの濃度が高い方)をパスツールピペットで，底からゆっくり重曹しています． 表層の細胞を使う時は，軽い方の液に細胞を懸濁しています．

少しずれるかもしれませんが、 削除/引用 No.2264-3 - 2008/11/17 (月) 23:08:42 - POM 私はDRGからニューロンを密度勾配遠心法で分離、精製して培養しています。最初、市販のHBSSで30％パーコールを作ってやってみたところうまくいかず、報告通り、HBSSをpH7.4 HEPES bufferでつくり、×10HBSSをそれで希釈し、最後に30%Percoll 100mlに対し、×10HBSSを3.3%加えるなどと、論文通りに行ったところ、細胞の回収率が改善しました。Percollを用いる際は、浸透圧等の問題があるようで、もし、参考としている報告にそのようなことが記載されてないかチェックするとよいかもしれません。ところで、よっしーさんの回答で、Percollは温度とブレーキが重要とありましたが、私はその点を知らないので、よかったら教えてもらえますか（別スレをたてないですいませんが）。

(無題) 削除/引用 No.2264-2 - 2008/11/07 (金) 13:47:33 - よっしー この本に出てますよ． http://www.yodosha.co.jp/book/9784897069098.html この本ではパーコールは使ってませんが・・・． パーコールは重層してますよね． 論文がどの様にしてるか分かりませんが，バンドが出るって事は， 2種類の濃度のパーコールの界面に細胞が来るって事ではないのですか？ ちなみにパーコールで細胞を分ける時は，遠心機の温度とブレーキは重要ですよ！

ラットオリゴデンドロサイトの分離 削除/引用 No.2264-1 - 2008/11/07 (金) 13:19:43 - tomy はじめまして。 今実験でラットの脳内からオリゴデンドロサイトを分離しています。 ラット脳を細かくし、トリプシンとDNaseにて酵素処理したあと、パーコールにて30000gで比重遠心しています。論文を見ると、比重遠心後にバンドが出るとなっているのですが、上層に脂肪の塊のようなバンドはでるもののそれ以外にはでません。 脂肪の塊のようなところ、中間層、下層をそれぞれ分取し、O4マーカーで染色し、脂肪の塊部分でFACSで確認するとFSCの低いところで、O4陽性細胞がいるようです。 どなたかラットからオリゴデンドロサイトを分離、培養していた経験があるかたがいましたら、そのときのプロトコルを詳細に教えていただけないでしょうか？ よろしくお願い致します。

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