全7件 ( 1 〜 7 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.21-8 - 2007/08/02 (木) 20:33:57 - キュウ 皆さんアドバイスありがとうございます。 293でさん ＞２-３日後にもう一度トランスフェクトすると これはどうなのでしょう？あまり聞かない方法ですし、どんな影響があるのか わからないのでできれば避けたいです。 TK-1さん ＞DNAのqualityの問題か、あとは細胞がmycoplasmaに感染 DNAはキアゲンのMidiキットでとっているので普通にとれていれば十分きれいだと考えているのですが。このレベルのqualityってODのratioではよく分らないですよね？マイコは有りうるかもしれません。最近チェックしてないので。 aaさん X−GalとGFPの検出力の件、X-Gal染色はしたことがないのでそういう違いが出るとは知りませんでした。確かにGFPをみていてうっすら光ってるっぽい細胞をどうすべきかは悩むところです。ただそういう細胞をポジティブと考えても、90%には遠いです。 flp-inは非常に魅力的ですね。買ってもらえるかな？ オタク2号さん LipofectAmine2000で90%ですか。やっぱうまくいくところではうまくいってるんですね。当たり前ですが。うらやましいです。確かに同じ名前の細胞でも、性質は結構違ってるんでしょうね。LipofectAmine2000も買おうかとも思ったのですが、最近LTXなるものも発売されたりとかで何がよいのやらよくわからなくて。293だったらどこの試薬でも高効率で入るものだろうと思ったのですが甘かったのか。 ~さん ＞Lipofectamine + Lipofectamine plus、OPTI-MEM培地で OPTI-MEMでコンプレックス形成させるということでしょうか？OPTI-MEMで細胞を短期間飼っておくということでしょうか？ ＞増殖に影響を与える遺伝子を導入したマスカルチャーのステーブルでは、増殖の早いもの(低発現？)の比率がだんだん増えていくので、評価が難しいです。 確かに評価が難しいですね。ただ増殖を促進するような遺伝子を導入するのであれば、遺伝子の影響を過剰ではあるが検出しやすいということになるのでしょうか。 ＞GFPを使って、FACSで発現している細胞を回収 これは、だと大部分はステーブルではない細胞を集めてくるわけですよね？ その場合、例えばトランスフェクションの1日後にFACSで選択して、播き直して対数増殖に入った後(2，3日後か？)に増殖変化を評価するわけですよね。その時まで発現が残っているのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.21-6 - 2007/08/02 (木) 09:04:49 - ~ Lipofectamine + Lipofectamine plus、OPTI-MEM培地で 293に90%以上入っています。 増殖に影響を与える遺伝子を導入したマスカルチャーのステーブルでは、 増殖の早いもの(低発現？)の比率がだんだん増えていくので、評価が難しいです。 GFPでFACSが使えるのならば、 薬剤耐性の代わりにGFPを使って、 発現している細胞を回収できませんか？

(無題) 削除/引用 No.21-5 - 2007/08/01 (水) 23:06:27 - オタク2号 　よくメーカーでは、自分の試薬がトランスフェクション効率９０％ などと謳っていますが、実際には研究室で飼っている細胞と メーカーが使っている細胞が、同じ名前でも性質が違うことが あるので、なかなか能書きどおりにはいかないものの様です。 　自分の経験ではGFPで見て invitrogenのLipofectAmine2000が安定して、 どの細胞にも高効率で入りました。 （うちの293の場合は９０％くらい。他の細胞はもう少し悪い）

(無題) 削除/引用 No.21-4 - 2007/08/01 (水) 21:20:02 - aa 効率を測定するときに、X-Galで染色してある例が多いと思いますが如何でしょうか？ X-Gal染色のときは、overnightで染色すると、ほんの少し発現していてもポジティブとして検出されます。メーカーとしても高い効率を表現するのに適当なのでは無いかと思ったりもします。 GFPを発現させたときに、どの程度の発現までをポジティブと見るかは、励起光の強度や、検出系の感度などで変わりますが、GFP蛍光が弱いと自家蛍光と区別できなくなりますから、強く安心できる蛍光しか検出しません。このあたりが「言われているほど効率が高くない」と感じる理由では無いのでしょうか？ と思って、効率上昇には、努力していません。（flp-inのような）recombinaseを使ったステーブル作成が可能なら、ステーブルを勧めます。

(無題) 削除/引用 No.21-3 - 2007/08/01 (水) 21:13:22 - TK-1 DNAのqualityの問題か、あとは細胞がmycoplasmaに感染しているんじゃないですか？

(無題) 削除/引用 No.21-2 - 2007/08/01 (水) 21:04:31 - 293で まあ、そんなものではないでしょうか。最初から高率の系をもっているひともいるかもしれませんが。 支障がなければの話ですが、２-３日後にもう一度トランスフェクトすると８０％以上になったことがあります。

トランスフェクション効率を上げたい 削除/引用 No.21-1 - 2007/08/01 (水) 20:30:09 - キュウ 293細胞にカチオンリポソームを使って６Kbくらいのプラスミドをトランスフェクションしています。使っているのは主にHuGENE HDとTransit−LT1で、マニュアルどおりに試薬とDNAの比を振ってみたのですがあまりうまくいかず。なかなかトランスフェクション効率があがりません。せいぜい40％ほど。293なのでもっと入るものと期待したのですが難しい。ちなみに導入効率はGFPでみています。 トランジェントに発現させて増殖の変化をみたいと思うのですが、論文などで同様の実験をみると90％以上で行っているようです。90％以上の効率を得る条件を探すというのはかなり大変なものなのでしょうか？培地なんかも影響するのでしょうか？今はDMEM/F12を使っています。293やcosのようなよく入る細胞ではみなさんどの程度の効率を得られてますか？ それから、ポリクローンでもいいから薬剤選択してステイブル株を取ることも考えているのですが、ポリクローン株ってみなさん普通は使わないのでしょうか？他のスレットをみても、基本的にクローニングしたほうが良いということのようですが。 まとまらない書き込みですみませんが、何か教えていただけることあればよろしくお願いします。

全7件 ( 1 〜 7 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

---