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ライゲーション 削除/引用 No.209-10 - 2007/10/03 (水) 00:57:53 - とり ＞通常のライゲーション反応(BamHI/PstI)を行っても、 ＞目的遺伝子の前方およびベクターの一部がなくなってしまいました。 ライゲーションは、どのタイプのキットを使っていますか？ クイックライゲーションを使うとそのような例が起こると聞いたことがあります。 実際、クラシカルなキットを使っていてトラブルを感じたことはありませんが、 最近のクイックライゲーションキットを使って 「ライゲーション後にインサートのサイズが短くなる」 という目にあったことがあります （インサートのサイズが長い場合のみ）。 当時、ラボの同僚も似たような状況になったため、 「使っているクイックライゲーションが悪いんだろう」と考え、 クラシカルなキットに戻したら解決しました。 ただし、それより前に別の会社（別の二つの会社）の クイックライゲーションを使っていた頃には、そんなトラブルは一切なかったので もちろんクイック全般が悪いわけではなく、製品差があるということです。

(無題) 削除/引用 No.209-9 - 2007/09/23 (日) 16:55:03 - 中年 シークエンスの結果がどのようであったのか、お書きになっている情報のみからでは判然としません。 ベクター配列＞謎の余計な配列＞プライマー配列＞目的遺伝子 ということでしょうか？それとも、 ベクター配列＞プライマー配列＞謎の余計な配列＞目的遺伝子 ということでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.209-8 - 2007/09/23 (日) 14:18:25 - linger 余計な配列、というのがよく分からないんですが、シークエンスの結果とWebから取ってきた配列情報を比較して、関係がない配列があるのを確認した、という事でしょうか？ この場合、そもそも手元にある配列は正しいのでしょうか？PubMed等では配列が間違っている事がたまにあるので。 あと、目的遺伝子「前」にあるという事なので、もしかしたら転写開始点が複数あり、ウイルスを増殖させていた環境下では予想していた場所より数10bp前から転写が行われる、という事は考えられないでしょうか？ 初心者なのであたっているか分かりませんが、検討してみて下さい。

(無題) 削除/引用 No.209-6 - 2007/09/19 (水) 04:00:26 - Eire > ＞珍しいことではありませんね。よくあります。 > そうなんですか。勉強になりました。発現ベクターでなくてもそういうこと > があるんですね。この様な場合は通常、どの様な操作を行うものなのでしょうか。 No.209-2 で ats さんが指摘されているように blunt-end ligation が最も手っ取り早いのではないでしょうか。私の場合、TOPO cloning では全くコロニーが生えてこなかったインサートを、pBluescript を使って blunt-end ligation で cloning したところ成功したことがあります。 この際、ベクター側を脱リン酸化、PCR 産物を blunting およびリン酸化することで、ベクターの self ligation を極力排除するように操作しました（使っている PCR 酵素が high fidelity で校正機能の強いものであれば blunting は必要ありません）。 あと、よく分からないのですが、これまでにシークエンスした PCR 産物にプライマー配列はきちんと含まれていたのでしょうか？また「余分な」配列はプライマーの内側にあるんですよね？いつも同じ配列が含まれているのならば、じつはそれが「本当の」配列であるという可能性はないのかな、と思ったものですから。

(無題) 削除/引用 No.209-5 - 2007/09/18 (火) 23:51:56 - ｵﾚﾝｼﾞ >う〜んとさん 説明がいたらなくて大変申し訳ございません。 挿入した配列をベクターの配列と比較してみたところ、相同性はありませんでした。う〜んさんのご指摘の通り、プライマーを変更しても関係のない配列の 挿入があった事で原因がますますわかりません。 ライゲーション反応ではTOPOで得られたクローンから別のベクターに PCRで制限酵素サイトをつけた後、再クローニングを試みました。 ＞珍しいことではありませんね。よくあります。 そうなんですか。勉強になりました。発現ベクターでなくてもそういうこと があるんですね。この様な場合は通常、どの様な操作を行うものなのでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.209-4 - 2007/09/18 (火) 23:24:03 - う〜んと 最初の投稿がよく理解できないんですが。 >ﾌﾟﾗｲﾏｰを変えたりとやり直しをしてみても、全く >同じ配列が挿入されてしまいました。 通常PCR反応の条件が悪くて余計なプロダクトが出来るにしても、プライマーを変えても全く同じ配列が出来ることは非常に考えにくいです。 pENTRベクターのatt配列などのベクター配列の一部ってことはないですか？ >通常のライゲーション反応(BamHI/PstI)を行っても、 >目的遺伝子の前方およびベクターの一部がなくなってしまいました。 TOPOのクローンを再クローニングしようとしてるんでしょうか？ 制限酵素消化の配列がインサートに含まれているか、条件が悪いか？よくわかりませんね。 >クローニングベクターの場合でも遺伝子のせいで大腸菌での増殖がうまく >行かないという事も起こりうるのでしょうか。 珍しいことではありませんね。 よくあります。

(無題) 削除/引用 No.209-3 - 2007/09/18 (火) 21:54:21 - ｵﾚﾝｼﾞ >atsさん ｱﾄﾞﾊﾞｲｽありがとうございます。今後の参考にしたいと思います。 書き忘れてしまったのですが、現在組み込んでいるのは発現ベクターでは ありません。クローニングベクターです。 この場合、PCRがうまくいっていないという事でしょうか。 クローニングベクターの場合でも遺伝子のせいで大腸菌での増殖がうまく 行かないという事も起こりうるのでしょうか。 ベクターも後々の発現系のことを考えると、変更は出来ないんです。

(無題) 削除/引用 No.209-2 - 2007/09/18 (火) 21:33:17 - ats PCRがうまくいっていないのか、クロ−ニング（大腸菌でのplasmidの増殖）がうまくいかないのか切り分けるために、(1)発現ベクタ−ではないただのcloning vectorにクロ−ニングしてみてください。 この場合は、BamHI/PstIで消化する前のPCR産物を、クロ−ン化の方向は関係ないようにblunt end ligationするのが良いでしょう。 これで正しい配列のクロ−ンが得られたら、たっぷりのplasmidをBamHI/PstIで切り出して、目的の発現ベクタ−に組み込んでみましょう。これで組み込めないようでしたら、その発現ベクタ−をあきらめる？？ 過去のまれな経験では、(2)クロ−ン化するベクタ−を変えてみただけで目的のクロ−ンが得られたり、（例えば、pCR-Blunt-TOPOでだめでpCRscriptでOKとか、相性？？） (3)コピ−数が少ないvector（pUCではなくpBR322系やp15A系など）でやっとクロ−ン化できた遺伝子もありました。 (4)SURE2株やStbl株など特殊な菌株を利用するのも良いかもしれません。 (5)知人から聞いた話ですが、37度ではなく25度ならうまく行ったこともあるそうです。 もし大腸菌用発現ベクタ−にクロ−ン化しようとしているのでしたら、目的の遺伝子産物が大腸菌にとって毒性がある可能性があるので、より厳密な制御が可能な発現ベクタ−・菌株を利用してみるのも解決法です。

ｲﾝｻｰﾄがﾍﾞｸﾀｰにしっかり入りません 削除/引用 No.209-1 - 2007/09/18 (火) 20:49:14 - ｵﾚﾝｼﾞ いつも参考にさせていただいております。 現在、ウィルス由来の遺伝子を発現しようとしているところです。 RNAを抽出し、RT-PCRで目的遺伝子の増幅を行い、 TOPOクローニングでベクターに遺伝子を挿入しました。 シークエンスを行った所、目的遺伝子の前に全く関係のない 配列が数十bp（余計なATG含む）挿入しました。　 ﾌﾟﾗｲﾏｰを変えたりとやり直しをしてみても、全く 同じ配列が挿入されてしまいました。 通常のライゲーション反応(BamHI/PstI)を行っても、 目的遺伝子の前方およびベクターの一部がなくなってしまいました。 さらに別の方法で試みても全て逆向きに入ってしまい、正しいコロニーが 得られません。 周りに遺伝子操作を行っている人がおらず相談相手がいません。 私も遺伝子操作に詳しくないので困っています。 この様な場合どうすればよいのでしょうか。よろしくお願いします。

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