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(無題) 削除/引用 No.2048-18 - 2009/08/31 (月) 13:30:08 - yaggy 自分も時々同様の実験を行います。20bp程度の短いオリゴ由来のインサートはインサートのPNK処理・ベクターのAP処理により確実に挿入できますが、40bp以上の長いオリゴの場合はインサートとなるオリゴの品質の問題で入りにくくなります。 何回か試してみた限りでは、Operonから購入したものについてはすんなり入りますが、SIGMAから購入したものはこの長さでは若干入りにくい印象です(短いインサートは全く問題ありませんが)。

たくさんのご助言ありがとうございます。 削除/引用 No.2048-17 - 2009/03/29 (日) 16:25:22 - ポケットハムスター 諸事情により本実験よりしばらくの間遠ざかっておりまして、最近またはじめることになりました。 皆様のご教授どおり、T4 PNKを購入しリン酸化させ、vectorをBAP処理するようにいたしました。しかし、前回同様全く入る兆しが見えません。 TaKaRaのT4 PNKを用いて、同社のプロトコルに沿って行っているのですが、全くダメです。http://catalog.takara-bio.co.jp/PDFFiles/2021A_DS_j.pdf コロニーは10個程度しか生えてきませんが、すべてvector由来のものしか生えてきません。oligoの配列が大腸菌に悪影響を与えているのかもと思い、配列を変えたのですが変化はありません。50bpのoligoを挿入するのは難しいのでしょうか。何か改善する点、よい方法などがございましたら再度ご教授いただければ幸いです。

(無題) 削除/引用 No.2048-16 - 2008/10/05 (日) 05:58:06 - おお あ、そうそうオリゴ(一本鎖)同士をアニーリングしているわけですから、きっちりアニーリングしたものだけをPAGEで電気えいどうし、切り出してつかうともっとよくなるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.2048-15 - 2008/10/05 (日) 05:51:08 - おお Stu1が使えない場合があるかもと、ちょっと違う方法を。 たしかにそのほかのブラントの酵素を使うてもありますが、 例えばEcoRIできって、クレノーをかけるとセルフライゲーションが起こった時にXmn1サイトが生じます。 ですからオリゴをライゲーション後このばあいはXmn1で切るという手がとれます(ベクターやインサートないにその酵素の認識配列がないという前提ですが)。そういうふうに注意深く見ていくと EcoR1でクレノーで同時にAse1/AsnI/ PshBI/Vsp1サイトが生じますし、BamHIならClaI(このときdam メチレーションのサイトとオーバーラップしますがクレノーによって合成してますので、ライゲーション後は切れるはず)がしょうじます。HindIIIならNheI、XhoIならSph1、NotIならNaeI/Fse1、、興味があればそのほかもチェックされるといいかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.2048-14 - 2008/10/05 (日) 04:47:30 - おお >[Re:13] APさんは書きました : > 比率をどう工夫しても、self-ligationが優勢になるのは目に見えていますが、インサートにStu Iがないならば、ligation産物をStu Iで消化して、自己環状化したプラスミドを排除するといいでしょう。 >[Re:3] おおさんは書きました : > どうしてもそのまま入れたいのであれば、インサートが入った状態でStu1の認識配列ができないのであれば、ライゲーションのあとStu1で切るという手がとれます。 そうそう、これ結構使えるんだからやってみなさいよ。それともStu1サイトがインサートにあるか、ジャンクションにできてしまうのでしょうか、、、 >[Re:13] APさんは書きました : > >ただ単にリン酸化酵素が無いからこの実験を行っているのです。 > > 購入するという選択肢は端から論外なのですか？ わたしも購入すればいいのにとおもいます。単発でそれ以降使わないというのであれば、日頃からそういう仕事をしているちかくのラボにいって使わせてもらうとか、、、 酵素がないために50このコロニーをスクリーニングして、それでもダメであと50とかやっていると時間や人権費でどれだけ消費しているかと言うことを考える必要がある環境でしたら、１度考慮された方がいいかもしれません。PNKは買わないけど、オリゴはデザインして買い直すことは出来る訳でもないですよね。 ま、使わないならこういう場合はコロニーPCRやコロニーハイブリダイゼーションをスクリーニングで使う方が早いかもしれません(コロニーPCRは普段は否定的ですが)。 >インサートとベクターの比をふってみるとありますが、どのくらいの比がよいのでしょうか？？ わたしは100倍以上と申し上げておきます。100から1000倍でトランスフォーメーションの効率に阻害が見られるあたりがいいかと思います。 こちらで、コメントを書かれている方で、PNKなしでこのような仕事をなさった方がいられるようですが、ポジのコロニーの頻度はどのくらいかという情報をお示しになってはどうでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.2048-13 - 2008/10/04 (土) 19:39:54 - AP >ただ単にリン酸化酵素が無いからこの実験を行っているのです。 購入するという選択肢は端から論外なのですか？ たいていのメーカーでは最小包装で1万円くらい、たとえばInvtrogenなんかでは5千円くらいで買えるのですが。それでも、そして試行錯誤のために試薬や労力が余計かかろうと、人力と根性で乗り越えようと、、、（それぞれ事情があるでしょうから止めはしませんが）。 >インサートとベクターの比をふってみるとありますが、どのくらいの比がよいのでしょうか？？ 普通のサブクローニングで、ベクターに対してインサートがモル比で1〜10倍くらいが適正範囲ですね。二重消化や脱リン酸など、セルフライゲーションを抑止する処理がないばあい、その10倍のくらい範囲（10〜100倍）を目安にするといいと思います（TAKARAの、脱リン酸、非脱リン酸ベクターに対するリンカーライゲーションに関するガイドからの演繹）。 インサートを増やす分、全体にDNA濃度が上がり、環状化よりconcatemer化（多数の分子の直列化）が起こりやすくなるでしょう。反応体積をスケールアップしてDNA濃度があまり高くならないようにしたほうがいいと思います。 また、もともと起こりにくい分子間の平滑末端ligationなので、PEG8000が5%程度入った反応液が助けになるかもしれません（たまたま、別のトピで話題になっていますが）。 比率をどう工夫しても、self-ligationが優勢になるのは目に見えていますが、インサートにStu Iがないならば、ligation産物をStu Iで消化して、自己環状化したプラスミドを排除するといいでしょう。

(無題) 削除/引用 No.2048-12 - 2008/10/04 (土) 19:16:31 - メタボ 私の言ってる方法なら、理屈の上からはインサートが多ければ多いほど良いということになります。 そうじゃない場合は、ベクターとインサートの長さにも依存するので一概には言えませんが、インサートがモル比で数倍というところかな。

ご助言ありがとうございます。 削除/引用 No.2048-11 - 2008/10/04 (土) 17:30:55 - ポケットハムスター ただ単にリン酸化酵素が無いからこの実験を行っているのです。 インサートとベクターの比をふってみるとありますが、どのくらいの比がよいのでしょうか？？

(無題) 削除/引用 No.2048-10 - 2008/10/04 (土) 01:03:12 - おお オリゴですから大過剰に入れるというのができますので、ベクターを脱燐酸化せずにやっても、ほかのサブクローニング(ベクターから切り出したものをインサートにするとか)よりは、頻度が高くもしかしたら、インサートが入ったものが得られる可能性があります。 でもベクターを脱燐酸化、インサートを燐酸かすることによってかなり確実にインサートが入ることがおおいです。酵素が問題なく働いていて、オリゴがたまたま変な構造を取りやすいとかでなければ、90%ぐらいがインサートが入ったクローンが得られるとおもいます。

(無題) 削除/引用 No.2048-9 - 2008/10/03 (金) 21:36:31 - A 平滑末端ではありませんが合成DNAの短いインサート（30bp前後）を 用いたライゲーションをこれまでに100ｸﾛｰﾝ以上したことがあります。 インサートの準備は 　１．アニーリング（最終濃度;50uM/Primer） 　２．リン酸化 　３．フェノクロ 　４．エタ沈 を行いペレットをDDWで溶解しました。 経験から言えることはこれくらい短いインサートは入りにくくしちみさんが おっしゃっているように数ポイントインサートとベクターの比を振らないと なかなかコロニーが得られなかったということです。これはこの比が クリティカルであるにもかかわらずエタ沈による回収率がまちまちでうまく その比を固定できないからと想像しています。私の場合、概してインサート の量が少なめのほうが入りやすかった印象でしたからトピ主さんのように 過剰に入れると目的のクローンが得られないのではと思います。 また私の同僚は一度一つのインサートで 　１．インサート（リン酸化）　　−ベクター（脱リン酸化） 　２．インサート（リン酸化せず）−ベクター（脱リン酸化せず） 　３．インサート（リン酸化）　　−ベクター（脱リン酸化せず） でインサートの比を幾つか振ってライゲーション結果を比べたそうですが 一番良い結果が得られたのは１．のパターンだったそうです。たった１回の 実験ですからこれがいつでも当てはまるかどうかわかりませんが少なくとも １．の組み合わせは悪くなさそうです。皆さんがおっしゃるようにリン酸化 されては？

(無題) 削除/引用 No.2048-8 - 2008/10/03 (金) 21:18:32 - しちみ ↓の実験は当時ラボにPNKが無かったからで、酵素があれば使うほうが楽だし安いでしょうね。

(無題) 削除/引用 No.2048-7 - 2008/10/03 (金) 20:56:32 - しちみ この実験は、昔やったことがあります。 PNKする必要はありませんが、インサート量をふってやった記憶があります。 インサートはモル数をちゃんと計算して多めの適正量ぐらいでないと入りません。 合成DNAが大過剰量だとベクターの両端にそれぞれ1分子ずつライゲートして、合成DNA同士はリン酸化されてないので、環状化しないようです。

(無題) 削除/引用 No.2048-6 - 2008/10/03 (金) 19:31:11 - メタボ Biotechniquesの綴りを間違えました。

(無題) 削除/引用 No.2048-5 - 2008/10/03 (金) 19:29:51 - メタボ インサート大過剰の条件でライゲーションすると、ベクターの両端にニ本鎖のオリゴがそれぞれ一方の鎖はニックを残し、他方の鎖のみベクターと共有結合した産物ができますよね。これを熱変性して共有結合していない鎖を除き、ゆっくり室温に戻すことで一本鎖部分がアニールした環状分子が取れるというプロトコルをNARだかBiotechnicだかで読んだ覚えがあります。

なぜ？ 削除/引用 No.2048-4 - 2008/10/03 (金) 17:22:47 - DDD >インサートはそのまま用いるのではなく、これも精製した方がよいのでしょうか？ 何か、現行（リン酸化酵素などを用いず）の方法で訂正すべき所はありますか。 なぜリン酸化酵素を用いないのかわかりません。 合成オリゴにPを付けて注文するか、みなさんのご指摘のように オリゴをリン酸化、ベクターを脱リン酸化すべきです。

(無題) 削除/引用 No.2048-3 - 2008/10/03 (金) 07:13:32 - おお >[Re:2] APさんは書きました : > いや、やっぱりインサートをpolynucleotide kinaseでリン酸化して、ベクターを脱リン酸するのがベストではないですか。 私もそう思います。オリゴをPNKで燐酸かするのはたまにやります(プライマーとかで)しうまくいっています。 どうしてもそのまま入れたいのであれば、インサートが入った状態でStu1の認識配列ができないのであれば、ライゲーションのあとStu1で切るという手がとれます。 あとクレノーとかした方がいいというのも私も賛成です。 あと思いつくのはアダプターでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.2048-2 - 2008/10/03 (金) 01:40:35 - AP いや、やっぱりインサートをpolynucleotide kinaseでリン酸化して、ベクターを脱リン酸するのがベストではないですか。 もう手遅れですが、アニールした時に末端が一本鎖の付着末端になるようにしておけばよかったですね。 >オリゴは約50kbです。 50 bpの間違いでしょうか。約50kbではオリゴとは言えない、、、、、 合成機で長いDNAを合成するとエラーがかなりあります。おそらくアクリルアミド電気泳動などで正しい長さのを精製はしていると思いますが、末端がミスマッチになっていたり、長さがそろっていないのがあるかもしれません。 klenowかT4 DNA polで平滑化するといいかもしれません。 または、TaqとdNTPで72℃でしばらく反応させて（サイクルにはかけないで）、Aの突出を作って、TA cloningするとか。これならインサートのリン酸化やベクターを脱リン酸しなくてもよくて一石二鳥。

oligo由来のインサート（平滑）をベクターに入れたいのです。 削除/引用 No.2048-1 - 2008/10/03 (金) 01:10:46 - ポケットハムスター オリゴは約50kbです。 これらを９４℃５分加熱し、室温に戻してそのままインサートとしました。平滑末端です。 ベクターは、stu1 で切断し、フェノクロ処理し精製しました。 これらをO/Nでラゲーションし、E.coliにトランスフォームし、ミニプレで確認を行っています。 オリゴ由来であるため、ベクターは脱リン酸化処理できず、そのままライゲーションを行っています。もちろん入りにくいのは承知ですから、インサートの量を莫大な量を用いていますが、 全く入る兆しがありません。 インサートはそのまま用いるのではなく、これも精製した方がよいのでしょうか？ 何か、現行（リン酸化酵素などを用いず）の方法で訂正すべき所はありますか。 ただの根性論で数をこなして行くしかないでしょうか？ ご教授ください。

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