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(無題) 削除/引用 No.194-6 - 2007/09/28 (金) 18:06:34 - swe MgCl2なし10xbufferを使ってて、MgCl2を反応系に入れてないなんてことはないですよね?

(無題) 削除/引用 No.194-5 - 2007/09/17 (月) 22:38:04 - 3'-5'exonuclease 普通のTaq polで増えるのに、proof-reading活性のあるやつだと増えなくなるという場合、考えられることの一つとして、 proof reading 活性のあるpolymeraseだと、試薬を加える順番や手際によって、3'-5'exonuclease活性でprimerが分解されて、増えなくなるとか、特異性が下がってエクストラバンドが出やすくなる可能性があります。 具体的にはprimerと酵素を共存させた状態で（とくにdNTP非存在下で）サーマルサイクラーにかけるまでに長時間置くと危険性があります。最後に酵素を加えたたら（あるいはprimerを最後に加えたら）速やかに反応を始めるべきです。 そのへんは問題ありませんか？（まあ、それでまるっきり増えなくなるとは考えにくいのですが）。念のため、primerをふだんより多めにするのもいいかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.194-4 - 2007/09/15 (土) 18:24:47 - ねこたろう rTaqやExTaq以外の酵素ではそのｃDNAは増幅できましたか？また、cDNAの品質等はどうですか？市販品や自分で増幅したcDNAで違うと思いますが、cDNAに鋳型として使われたmRNAが混じっていると増幅がうまくいかないこともあり、その場合cDNAの反応への持ち込み量を減らすなどの対策をしてRNAの反応系への持ち込みを減らすという対策もいるのかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.194-3 - 2007/09/15 (土) 01:34:41 - Ex 他のテンプレートでもExTaqだと増えないのでしょうか。 他の人が使った場合はどうでしょうか。 酵素が失活していたりはしないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.194-2 - 2007/09/15 (土) 00:19:09 - ねこたろう なぜ増えないのかはわかりませんが、ExTaq（タカラバイオ）はrTaqとくらべると3'-5'exo活性（proof　reading)があるのでプライマーの3'側がポリメラーゼによって削られる可能性があるからかもしれません。プライマーの3'側をGかCにして浮き上がりを防ぐようなプライマー設計が良いのかもしれませんね。使用中のプライマーの3'末端の塩基は何でしょうか？

ExTaqで増幅しません．．． 削除/引用 No.194-1 - 2007/09/13 (木) 21:18:19 - 初心者 　PCRでcDNAライブラリーからDNAを増幅しようとしているんですが、ExTaqを使うと全く増えません。rTaqを使うと普通に増えるのですが、どうもExTaqを使ったときだけ上手くいきません。ExTaqを使うと量が減るのはよく聞きますが、rTaqで普通に増えるのに、ExTaqで全く増えないのは何か理由があるのでしょうか？初心者のため全く分かりません。何かアドバイスのある方はよろしくお願いします。

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