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LAR2とGlo 削除/引用 No.190-4 - 2007/09/14 (金) 12:47:04 - あべちゃん 昔、プロメガのデュアルルシフェラーゼアッセイキットを用いていました。 細胞実験初心者さんは、実験の都合上、pRL-nullをレポーターベクターとして使用するという事ですね。 デュアルの系では「LAR２」と「Glo」の２種類の試薬でルシフェラーゼ活性を測定しています。 このレニーラ由来のルシフェラーゼ活性を測定する際、直接Gloの方を入れると活性が出ません。蛍由来ルシフェラーゼ(pGL3)を使わない場合でもLAR2を加えてから、Gloを入れなくてはいけません。 これは、プロメガの試薬がLAR2を加えた液にGloの試薬を入れて初めてレニーラ由来ルシフェラーゼの活性が最適になるように調節されているからです。 記憶が正しければ、レニーラ由来ルシフェラーゼの活性のみを測定する為の反応試薬も販売されています。 僕はプロメガの試薬でしか、ルシフェラーゼアッセイをした事がないので、他のメーカーの物を使っていた場合は、この指摘は当たらないかもしれません。 ご参考までにお伝えします。

(無題) 削除/引用 No.190-3 - 2007/09/14 (金) 11:52:03 - 細胞実験初心者 「あああ」さん アドバイスありがとうございます。 細胞自体は起こしてから１ヶ月は経っていないものを使っていますが，これから注意したいと思います。 そうなると，やはり試薬等の問題か，コンストラクトの問題かになるのでしょうか？

お役に立たないかもしれませんが、 削除/引用 No.190-2 - 2007/09/13 (木) 12:54:52 - あああ 細胞は、起こしてからどれくらい経っているのでしょうか？？ 私の経験上、293細胞を起こしてから1ヶ月以上継代していた物は、細胞の形質が変わるのか、トランスフェクションの効率がグッと落ちます。

HEK293細胞でのトランスフェクション実験 削除/引用 No.190-1 - 2007/09/13 (木) 11:22:56 - 細胞実験初心者 HEK293細胞を使ってトランスフェクション実験を行っている者です。 以前，pGL3にプロモーター領域を挿入したレポータープラスミドにPRL-SV40を内部コントロールとしてリン酸カルシウム法で共導入してルシフェラーゼ活性を見たときは，うまくいっていました。 ところが，実験の都合でPRL-nullに同じプロモーター領域を挿入したプラスミドと内部コントロールとしてのβ-ガラクトシダーゼ発現ベクターを同じ方法で共導入したとところ，活性が上がりません。 トランスフェクション後48時間たってlysis bufferで細胞を溶解するときに以前はごく短時間で溶解していたのですが，PRL-nullを用いたレポータープラスミドを導入した場合は細胞が溶解されていないように思われるのです。 この原因として ・導入遺伝子が変わったのでHBSのpHなどの条件を変える必要がある ・遺伝子の精製度合い（260/280比で1.8-1.9程度になっているのですが・・・） などを考えているのですが，どの様な原因が考えられるでしょうか？またどの様に対処すればいいでしょうか？ 初心者ですのでばかげた質問かもしれませんが，御教示お願いいたします。

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