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(無題) 削除/引用 No.184-11 - 2007/09/13 (木) 14:01:37 - #5 私もPrime STARの増幅力に問題があると思っておりました。 以前まではEx Taqを使用していたのですが別の研究室に移りシークエンスが主な実験内容になったために正確性を重視したためにprime starを選択しとりました。 Ex Taqはもっているので試してみようと思います。 当初から使い慣れたEx Taqを使用しておれば良かったと少々反省しております。

(無題) 削除/引用 No.184-10 - 2007/09/13 (木) 10:38:13 - R Prime starは増幅力が弱い印象を受けました。 酵素をかえてみるのも、手かと思います。 私はPrime star→ExTaqで増えるようになりました。 正確性に難有りですが。

(無題) 削除/引用 No.184-9 - 2007/09/13 (木) 08:42:20 - #5 RNase処理は行っておりませんでした。 様々なtemplate濃度を試してみようと思います。 どうもありがとうございます。

RNase処理 削除/引用 No.184-8 - 2007/09/12 (水) 18:31:00 - 3 DNA抽出の途中でRNase処理の工程は入っていますか？ もししていない場合は、測定した濃度の中にRNAも含まれている可能性が あります。 DNAもRNAも核酸ですので、ratioや、分光光度計のグラフのピーク（260nm）は影響を受けずきれいに出ます。 その場合はその測定値通りに希釈してしまうと鋳型DNA量が少なすぎて増幅が確認できないことがあるみたいです。 ものによってその残り具合がまちまちだったりするようなので（私の手技のせいかもしれませんが） 分光結果をもとに同じ濃度になるように希釈しても増えるものと増えないものがあったりします。 私の場合はtemplate量を増やすことで解決したこと、非特異増幅ではないことが確認できたのでRNase処理は特に行っていません。 template量何パターンかふってみたらいかがでしょう？ RNase処理をなさっているなら失礼いたしました。

(無題) 削除/引用 No.184-6 - 2007/09/12 (水) 15:39:54 - #5 >[Re:4] ~さんは書きました : > >同様に処理した物で濃度も他のものと変わりません > > 汚いかどうかは濃度だけでは分かりません。 > その個体から複数回抽出した場合でも、どれも増えないのですか？ 同一固体からの抽出は一度しか行っておりません。 もう一度、血液から抽出し直してみるのも試してみます。 ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.184-5 - 2007/09/12 (水) 15:38:47 - #5 >[Re:3] げるさんは書きました : > ゲノムはどの部位から抽出していますか？ 血液からです。 > 抽出は何をお使いですか？ ＱＩＡＧＥＮのＤＮＡ抽出キットです。 > PCR産物の大きさはどのくらいですか？ いくつかプライマーを試しましたので、場合によりますが１５００〜２０００ｂｐです。 > Ratioで見て抽出溶液は純度はきれいですか？ 純度は問題ありません。 何かわかりましたらお願いします。

(無題) 削除/引用 No.184-4 - 2007/09/12 (水) 15:32:32 - ~ >同様に処理した物で濃度も他のものと変わりません 汚いかどうかは濃度だけでは分かりません。 その個体から複数回抽出した場合でも、どれも増えないのですか？

(無題) 削除/引用 No.184-3 - 2007/09/12 (水) 15:28:13 - げる ゲノムはどの部位から抽出していますか？ 抽出は何をお使いですか？ PCR産物の大きさはどのくらいですか？ Ratioで見て抽出溶液は純度はきれいですか？

ゲノムＰＣＲ 削除/引用 No.184-1 - 2007/09/12 (水) 14:38:58 - #5 ある動物のゲノムをＰＣＲ増幅しております。 しかし、個体によっては増幅しないことがあります。 プライマーを変えてもどうしても増幅しない個体がいます。プライマー部分の変異は複数のプライマーを使用していることから少ないと思っています。なかにはどのプライマーにしても増幅しません。 この場合、考えられることとして鋳型ＤＮＡが良くないことがあると思うのですが同様に処理した物で濃度も他のものと変わりません。 鋳型ＤＮＡとして問題になる点として何かお気づきになる点がありましたらぜひ教えてください。 ちなみに使用している酵素はＴａｋａＲａのprime starです。３’→５’エキソヌクレアーゼ活性が非常に強い物です。

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