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(無題) 削除/引用 No.1739-14 - 2008/08/08 (金) 20:09:46 - 未熟者 やっぱりコロニーPCRはやめることにします。さまざまなご意見ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.1739-13 - 2008/08/08 (金) 19:22:28 - AP >２０個ほどコロニーを拾ってきて全くバンドが出てないものもあります。プレートに塗ったテンプレートから増えてくるなら、拾ったコロニー全てからバンドが出てきそうな気がするのですが、どうなんでしょうか？ 逆に、コロニーが生えていないところをつついてインサート配列のプライマーでPCRをかけても、バンドが出ることは少なくないですよ。by-chanceで出たり出なかったりと言う方法を当てにするのは適当ではないでしょう。

(無題) 削除/引用 No.1739-12 - 2008/08/08 (金) 19:17:33 - 未熟者 >[Re:10] あべちゃんさんは書きました : > > > 結構いろんなベクターを使うので、最適化は気が進みません。。 > > > インサート内配列をプライマーにされてるとの事でしたが、 > インサートの種類の方が多いでしょうに。 > でも、コロニーPCRをやめる方向で検討されるとの事なので、まあいいんでしょう。 > 今回は別に最適化とかはやってません。プライムスターのプロトコールに記載されてる条件でそのままやってみただけです。

(無題) 削除/引用 No.1739-11 - 2008/08/08 (金) 19:15:37 - 未熟者 >[Re:8] 禿頭さんは書きました : > 一般論として、入って当たり前のサブクローニングをコロニーPCRでチェックするメリットって何なんでしょうか？ミニプレップを１コロニーだけで済ませられることですか。かなり困難な場合でも６コロニーも拾えば当たりがあるでしょうから、 名前のとおり「未熟者」です。どのくらいが入って当たり前なのか、簡単な場合でもどのくらい入るのかいまいちよく分かってないです。

(無題) 削除/引用 No.1739-10 - 2008/08/08 (金) 18:50:27 - あべちゃん > 結構いろんなベクターを使うので、最適化は気が進みません。。 > インサート内配列をプライマーにされてるとの事でしたが、 インサートの種類の方が多いでしょうに。 でも、コロニーPCRをやめる方向で検討されるとの事なので、まあいいんでしょう。 ただ、制限酵素チェックの場合、 ベクターに対してインサートが小さい（シグナルが見えない、見えにくい） ベクターサイズにかぶっている、 など、ケースバイケースで問題を考慮するのが面倒ですね。

(無題) 削除/引用 No.1739-9 - 2008/08/08 (金) 18:30:37 - EcoRI サブクローニングならコロニーPCRはする必要はあまり無いのでしょう。 コロニーが出て来て、mini prepに持って行くまで、 だいたい８時間ぐらい(朝９時から午後５時まで)ありますので、 マスタープレートを作るついでに…PCRでもしよう 程度でやるのではないでしょうか

(無題) 削除/引用 No.1739-8 - 2008/08/08 (金) 18:19:35 - 禿頭 一般論として、入って当たり前のサブクローニングをコロニーPCRでチェックするメリットって何なんでしょうか？ミニプレップを１コロニーだけで済ませられることですか。かなり困難な場合でも６コロニーも拾えば当たりがあるでしょうから、６コロニーを植菌してミニプレップでチェックするのは大した手間じゃないと思うんですけど。取れたDNAを使って次のステップにも進めることもできますし。 コロニーPCRで良さそうなら、いきなりMidiやMaxiのスケールでDNAを取るというなら分からないでもないですが、さすがにそんなことはしませんよね。

(無題) 削除/引用 No.1739-7 - 2008/08/08 (金) 17:58:52 - 未熟者 > あと、コロニーPCRするときは、できればM13 T3 T7 Sp6といったよく使われるベクター由来の配列を利用して、最適化条件でPCRした方が良いと、私は思います。 結構いろんなベクターを使うので、最適化は気が進みません。。

(無題) 削除/引用 No.1739-6 - 2008/08/08 (金) 17:55:51 - 未熟者 >[Re:4] おおさんは書きました : > >コロニーPCRで偽陽性が出ることってあるでしょうか？ > > 出る要因はいろいろあります。ここで結構議論されていると思います。 > > まず、インサートの配列だけで増えるようなプライマーを使った場合、あなたはトランスフォーメーションのときインサート(テンプレート)を大腸菌にまぜて、それ(テンプレート)をプレートに塗り、そのプレートに触れてコロニーを拾っていますよね。大腸菌にテンプレートが無くても、テンプレートを拾ってきている可能性を否定できますか? > ２０個ほどコロニーを拾ってきて全くバンドが出てないものもあります。プレートに塗ったテンプレートから増えてくるなら、拾ったコロニー全てからバンドが出てきそうな気がするのですが、どうなんでしょうか？ > 大腸菌をトランスフォーメーションした時、同時に複数のプラスミドが入ったとします。大腸菌は徐々にどれかに絞り込むみ、コロニーをミニプレップするレベルでは均一になっているように見えますが(つまりプレパレーションレベルでは問題ない)、コロニーの中には落ちていった(はずの)プラスミドを保有している菌が微量にぞんざいし、キメラになっている。 このケースなんでしょうか？ > ノンスペ。特にインサートの配列とベクター内の配列でPCRするとき、予め最適な条件を設定するというのはできない場合がありますので(たとえベクターの配列でF/Rともプライマーを設定しても、インサートが入った状態で条件が変わる可能性は大いにある)、適切な条件でPCRできているか分からない。 > たまたま該当する長さのバンドが出てくる可能性は低い気がするのですが、確かに断言はできませんね。。。 > ま、こういった 懸念があるのでコロニーPCRは、単純なインサート確認の時には私はしません。そこそこワークする方法ですが、、、結局はミニプレップして制限酵素で確かめてるでしょ。コロニーPCRの確認は当てにならないから確認しないといけないからとも言えますよね。 確かにこのほうがいい気がしてきました。。今後もコロニーPCRをやるかどうかちょっと検討しようと思います。

(無題) 削除/引用 No.1739-5 - 2008/08/08 (金) 17:24:57 - あべちゃん > コロニーPCRで偽陽性が出ることってあるでしょうか？ 色々有りますよ。おおさんがおっしゃる可能性以外にも。 シングルコロニーと思っているかもしれませんが、そうじゃない事がたまに起きます。 PCR産物をライゲーションして、クローンを得る時、変異が入ってしまっているクローンが混在しているかは、キャピラリーシーケンスしてもなかなか判別つかないですよね。 > 6.prime star HSでコロニーpcr(反応液中の各濃度buffer=1x, dNTP=0.2mM each, 酵素=1.25U, 液量50ul、PCR条件 98℃ 10sec, 55℃ 5sec, 72℃ 1min（プロトコール通り）) 老婆心ながら、PrimeStarをコロニーPCRに使うのって、もったいなくないですか？ あと、コロニーPCRするときは、できればM13 T3 T7 Sp6といったよく使われるベクター由来の配列を利用して、最適化条件でPCRした方が良いと、私は思います。

(無題) 削除/引用 No.1739-4 - 2008/08/08 (金) 15:53:55 - おお >コロニーPCRで偽陽性が出ることってあるでしょうか？ 出る要因はいろいろあります。ここで結構議論されていると思います。 まず、インサートの配列だけで増えるようなプライマーを使った場合、あなたはトランスフォーメーションのときインサート(テンプレート)を大腸菌にまぜて、それ(テンプレート)をプレートに塗り、そのプレートに触れてコロニーを拾っていますよね。大腸菌にテンプレートが無くても、テンプレートを拾ってきている可能性を否定できますか? 大腸菌をトランスフォーメーションした時、同時に複数のプラスミドが入ったとします。大腸菌は徐々にどれかに絞り込むみ、コロニーをミニプレップするレベルでは均一になっているように見えますが(つまりプレパレーションレベルでは問題ない)、コロニーの中には落ちていった(はずの)プラスミドを保有している菌が微量にぞんざいし、キメラになっている。 ノンスペ。特にインサートの配列とベクター内の配列でPCRするとき、予め最適な条件を設定するというのはできない場合がありますので(たとえベクターの配列でF/Rともプライマーを設定しても、インサートが入った状態で条件が変わる可能性は大いにある)、適切な条件でPCRできているか分からない。 ま、こういった 懸念があるのでコロニーPCRは、単純なインサート確認の時には私はしません。そこそこワークする方法ですが、、、結局はミニプレップして制限酵素で確かめてるでしょ。コロニーPCRの確認は当てにならないから確認しないといけないからとも言えますよね。

(無題) 削除/引用 No.1739-3 - 2008/08/08 (金) 15:46:11 - ~ > コロニーをピックアップする際に、PCR産物をよけるのは不可能でしょう。 能動的によけるのは不可能という意味で、 ピックアップの際にPCR産物が含まれない場合はあります。

(無題) 削除/引用 No.1739-2 - 2008/08/08 (金) 15:44:13 - ~ クロスコンタミさせていないという仮定の下で回答すると、 >コロニーPCRに用いるプライマーはベクターにつくような配列ではないです。 ということは、インサートに付くプライマーの組み合わせですか？ 4でプレートに塗ったライゲーション産物には、ライゲーションされていないPCR産物が山ほど含まれていますよね。 コロニーをピックアップする際に、PCR産物をよけるのは不可能でしょう。

コロニーPCR 削除/引用 No.1739-1 - 2008/08/08 (金) 14:58:06 - 未熟者 コロニーPCRで偽陽性が出ることってあるでしょうか？ 　ベクターとインサートをライゲーションし、産物を大腸菌にトランスフォームしたあと、コロニーPCRをしてバンドが確認されたコロニーのうち３つをミニプレップして、シークエンスしました。すると２つはベクターとインサートがライゲーションしたものだったのですが、１つはセルフライゲーションしたものでした。コロニーPCRに用いるプライマーはベクターにつくような配列ではないです。 ライゲーションの方法は下記のとおりです。 ベクター＝4.4k、インサート＝4.4k 1.制限酵素サイト（NheI, EcoRV)をつけたプライマーを用いてPCRを行い、インサートを得る 2.ベクターとPCR産物を制限酵素処理 3.TAKARA BIOのDNA ligation kit Ver 2.1で16℃,30minでライゲーション 4.DH5αにトランスフォーム 5.37℃ o/n incubate 6.prime star HSでコロニーpcr(反応液中の各濃度buffer=1x, dNTP=0.2mM each, 酵素=1.25U, 液量50ul、PCR条件 98℃ 10sec, 55℃ 5sec, 72℃ 1min（プロトコール通り）)

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