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RT−PCR トピック削除
No.125-TOPIC - 2007/08/29 (水) 18:03:21 - なかなか
今、K562細胞からRNAを抽出後、RT反応にてcDNA化し、それをtemplateとしてPCRなどの実験を行っております。

 一回目、RT−PCRの結果、アガロース電気泳動の結果、バンドがいくつか検出されたのですが、2回目同様の手技でPCRをかけると、バンドが一本に減少してました。スプライシングバリアントの検索なので、できればおおくのバンドが出てほしいのですが、どういう要因にてそのときのPCRの係り具合がかかるのか教えていただきたいです。2回目のPCRまでcDNAはー20℃に保存しておりました。もしかして、cDNAのほうに原因があると疑ってはいるのですが・・・どうか詳しい原因など参考になるアドバイスをいただけましたら大変助かります。どうぞよろしくお願いします。
 
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(無題) 削除/引用
No.125-2 - 2007/08/30 (木) 23:21:06 - agarose
私はcDNAを何本かに分けて調整した後-80℃で保存しています。
PCRを行った後、使ったcDNAは捨てて
新しいcDNAを取り出して使っています。
こうすることで何回も同じ結果を得ることができました。

RT−PCR 削除/引用
No.125-1 - 2007/08/29 (水) 18:03:21 - なかなか
今、K562細胞からRNAを抽出後、RT反応にてcDNA化し、それをtemplateとしてPCRなどの実験を行っております。

 一回目、RT−PCRの結果、アガロース電気泳動の結果、バンドがいくつか検出されたのですが、2回目同様の手技でPCRをかけると、バンドが一本に減少してました。スプライシングバリアントの検索なので、できればおおくのバンドが出てほしいのですが、どういう要因にてそのときのPCRの係り具合がかかるのか教えていただきたいです。2回目のPCRまでcDNAはー20℃に保存しておりました。もしかして、cDNAのほうに原因があると疑ってはいるのですが・・・どうか詳しい原因など参考になるアドバイスをいただけましたら大変助かります。どうぞよろしくお願いします。

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