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ありがとうございました。 削除/引用 No.116-43 - 2007/09/12 (水) 13:27:24 - 6487 > 名無し さん コメントありがとうございました． それは無いと思います･･･． 抗体のデータシートを確認しました． ポジコンや培養細胞など何万もかけたsampleをもらえなかったことに 対する不満や、自分のお金で実験しているわけではないことなど、 実験させて貰っているという謙虚さが無かったと思います． 基礎学力がないとトラブルシュート出来ないのは当たり前で 研究職としての姿勢を正して、今後臨みたいと思います．

(無題) 削除/引用 No.116-42 - 2007/09/11 (火) 17:53:38 - 名無し まさかとは思いますが、１次抗体と２次抗体の組み合わせは適切ですよね？ 動物種や抗体のアイソタイプなど･･･ うちには以前、免染でIgMの抗体ですめるのに、 ANTI−IgGの２次抗体を使用して 一生懸命真っ白な切片を量産していた院生がいました 本人はまったく原因に気付いておらず

本当に有難うございます． 削除/引用 No.116-41 - 2007/09/11 (火) 16:52:04 - 6487 ＞油屋さん　 技術だけでなく実験にあたる姿勢など基本中の基本まで教えていただいて なんだか情けないです． たんぱく屋さんには個人的にメールを送らせて頂いたのですが このトピックもあまりに長くなってきたので、一度終了させようと思います． Westernは数回したことがありますが、これまでは成功していました． ただ、基礎をしっかりやっておらずWestern専門の方のを見て そのまま同じ事をしてこれまで出ていたので、今回も一度見て出来ると 周りも自分も思っていたのですがまるっきり出ません． もう後2週間ほどなので、出来る限り今のラボのやり方にとらわれず 基礎の本を読み直してやり直してみようと思います． ＞FASさん　244 さん posi conのことですが、うまくいっている方が抽出した膜や sampleはあるのですが、ラボの事情でいただけません． ですが、Westernはこれからも続けていく技術ですので なんとか検出できるよう頑張りたいと思います･･･． ＞SDSさん transferしたらmarkerが消えてしまいました･･･． コメントいただいた全ての方に心から深く感謝いたします． もう少し基本的技術を上げて、別の名前で出現します． ありがとうございました。

基礎知識は必要 削除/引用 No.116-40 - 2007/09/11 (火) 15:05:53 - 脂屋 元・たんぱく屋です。今は脂をやっている者です。 実験は、失敗が起こったときこそチャンスです。 どの行程がよくなかったのか、それともたまたまの手技の問題か、 ここで相当のストレスを我々はかかえるものです。 実験を行なう人間は正直しんどいですが、再現性のある動きが 要求されます。 ですので、ケアレスミスは大きな痛手であること、 つまりそれは時間のロス、研究費のロス、モチベーションのロス　etc につながりえると思います。 わたくしも文章を拝見していて、ケアレスが多いのでは…と 感じてしまいます。 少し前の「たんぱく屋」さんもおっしゃられているように、 教科書通りにいかないことが多々あります。 しかしこの前提には 「教科書通りにやってみて」「教科書通りにいかなかった」 という行程があると思います。 そこから始まる応用には、基礎の知識は一番必要です。 そして周りの経験者からのトラの巻も大きなツールです。 多くのみなさまからのご助言は、すべてすばらしいです。 読ませていただいているわたくしも勉強になっています。 落ち着いて、じっくり実験に取り組まれますよう。

(無題) 削除/引用 No.116-39 - 2007/09/11 (火) 14:25:47 - 244 私もFASさんの意見に賛成です！！ わざわざ市販のものを購入するよりも同ラボで成功されているlysateを使用されたほうが近道だと思いますよ。

(無題) 削除/引用 No.116-38 - 2007/09/11 (火) 14:12:24 - FAS 書き直しです、すみません。 同僚の方が何かlysateを持っていらっしゃるのでは？と思ったので、その方々から少し分けてもらってやってみる。アクチンが出ればWBの手技自体は問題ないと判明すると思いますよ。

(無題) 削除/引用 No.116-37 - 2007/09/11 (火) 14:09:27 - FAS ＞とりあえず市販のセルライセートを購入しておこなってみてはどうでしょうか？ ＞サンプルの問題か、WB手技(抗体反応含む)の問題かははっきりすると思うので。 私も一点さんの意見に賛成ですが、同僚の方のサンプルだと直ぐにできるのでは？

(無題) 削除/引用 No.116-36 - 2007/09/11 (火) 12:45:10 - 6487 ＞SDS さん プレキャストのゲルにSDSが入っていないのは知りませんでした． WAKOのカタログには書いてありました． (第一は書いてありませんが多分入っていないと思います) PVDF膜はtransfer前の浸透でSDS抜きのものを使いました． これからtransferのとき実行してみようと思います． ＞ 244さん そのとおりです･･･． 私の書き方が悪く申し訳ありません． ＞ 一点 さん 市販のセルライセートがあるんですね。 上と相談して購入可能か検討してみます． 皆様、ありがとうございました。

基礎学力 削除/引用 No.116-35 - 2007/09/10 (月) 23:34:38 - たんぱく屋 6487さん こんにちわ。 これまでのあなたのお話をきいておりますとタンパク系の経験はないようですね。だからこちらで質問されておられるわけですが。 ＞プラスマイナスの間違いと、２次抗体の間違い･･･． ＞今のとこ、大きなケアミスはそれくらいです(たぶん)． ケアミスといってしまうあたり少々問題があると思います。 これまでの皆様のアドバイスを読まれて様々な要素があると感じられておられるはずです。 まずはタンパク系の基礎学力をつけられてから、実験されたほうが良いと思いますよ。 実験系によって教科書通りにはいかないことは多々あるので、知識ばかりで技術がないのも問題ですが、今の6487さんの場合は知識不足を感じます。 皆様も応援されているので、なんとかバンドを出したい気持ちはわかりますが、抗体とか高いですし、所属されているラボは市販のゲルを使用とのことで、1枚2000円位してると思いますよ。 もちろんご自分でとられた研究費でしたら自由ですけどね…

(無題) 削除/引用 No.116-34 - 2007/09/10 (月) 21:38:11 - 一点 とりあえず市販のセルライセートを購入しておこなってみてはどうでしょうか？ サンプルの問題か、WB手技(抗体反応含む)の問題かははっきりすると思うので。

vortex5min？？？ 削除/引用 No.116-33 - 2007/09/10 (月) 18:26:58 - 244 >vortex 5min x3→13200rpm 4℃ 5min 遠心． ではなく、vortex後→ 5min静置（４℃）これを3回ではないでしょうか？ 5minもvortexし続けたら一部でもタンパクが壊れてしまうような気がしますが…いかがでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.116-32 - 2007/09/10 (月) 17:04:09 - SDS 転写バッファーがTris pH8.3/glycin/MeOH(20%)とのことですが、1-2％程度のＳＤＳを加えた方がいいかもしれません。 以前、BioRadのレディーゲルを使用した際、転写バッファーにＳＤＳを加えずに転写したところ、シグナルが出ませんでした。全ての試薬を作り直しましたが、改善が見られませんでした。 しかし、転写バッファーにＳＤＳを加えたところ、明確なシグナルが検出できました。その理由として、自作ゲルのプロトコルでは転写バッファーにＳＤＳを加えませんが、ゲルに含まれるＳＤＳがＷＢにも持ち越されている、一方、レディーゲルはＳＤＳが含まれておらず、ＷＢ時にバッファーから供給してやらないといけないと勝手に考えております。 ＷＡＫＯ製のゲルもNative PAGE 用だとしたらＳＤＳが入っていないと思います。 サンプル調製の問題ならば上記指摘は当てはまりませんが、御参考になれば幸いです。

(無題) 削除/引用 No.116-31 - 2007/09/10 (月) 13:37:17 - 6487 >Yumさん コメントありがとうございました． 結局裏表は関係なく、またdetect出来ませんでした．<えーっとさん >1. Lysisの際，10cm Dishに100ulのlysis bufferと記載されていますが，細胞回収後のペレットへの添加ならばともかく，Dishへ直接100ulでは少ないと感じます．ちゃんとLysisされてますか？ 濃度測定の段階では、前任者とほぼ同様のタンパク量がとれています． >2. Lysis後のサンプルに合計15分間もvortexをかける必要あります？． どうなんでしょうか･･･．この点は現在のprotocolに従って行っております．　 かけすぎるとどうなるんでしょうか． >3. 核内タンパクの検出とありますが，細胞質分画，核分核と分けてから泳動されているのでしょうか．分画の方法は適切でしょうか？ いえ。それ以前にActinが検出されないの分けていません．というか、核内にあるタンパクをWesternする時でもここのラボでは分画していません． >4. DNA漏出による粘度上昇は解決されたうえで泳動されてますか？ NP-40で抽出しているので、DNA漏出によるどろどろはありません。 >5. >だいたいreporobeしてからactin抗体をかけます.とありますが，strip用のバッファーは適切なものですか？．転写後直接アクチンを染められていたならばここの問題はなさそうですが． 現在はActinをWesternしているので、stripは問題ないです．そしてstrip bufferは購入しているものなので大丈夫なはずです． >6.タンパク濃度の測定に間違いはありませんか？ 濃度測定を教えて貰った人に手がかりとして、BCA法(Biorad)で測定した際のOD値は見せていただきましたが、大幅な差異は無かったです． >わずかでも解決の糸口となれること期待致します． 僅かな情報でも頂きたいので、本当にありがとうございました．

今度だめならー補足 削除/引用 No.116-30 - 2007/09/08 (土) 09:45:58 - Miso 細胞の数に関しては、50% confluence以上のdishを使っているという前提です。

今度だめなら 削除/引用 No.116-29 - 2007/09/08 (土) 09:43:28 - Miso このprotocolでやってみてください。ただし10 cm dishでは細胞が多すぎると思います。Actinならば6-well（あるいは35 mm dish）でも検出できるはずです。それから、Blocking solutionは、必ず、用事調整してください。感度が顕著に下がることがあります。 1. (Optional) Wash cells with icne-cold PBS (-) twice. 2. Harvest cells in 1 ml PBS (-) using Cell Lifter (Corning) on ice and transfer the suspension to a 1.5 ml microsentrifuge tube (an aliquot can be kept for protein assay.) So far, Cell Lifter is the best to harvest cells from a plastic dish. 3. Spin at 5,000 rpm for 5 min at 4C. 4. Remove sup. 5. Add 100 μl of 1X SDS sample buffer (2% SDS, 10% glycerol, 5% 2-mercaptoethanol, 62.5 mM Tris-HCl, pH6.8) to the pellet (if the pellet is bigger than 10-20 μl, use 2X sample buffer to make the final concentration of the sample buffer to 1X, e.g. add 100 μl of 2X sample buffer and 70 μl of distilled water to a 30 μl cell pellet). 6. Resuspend the pellet until it becomes fluid (until the viscosity becomes negligible for pipetting.) 7. (Optional) Boil for 3 min. 8. Apply 10 to 20 μl/lane to a SDS gel (it would be a good idea to use a prestained molecular weight marker such as Rainbow Marker from GE HealthCare, formerly Amersham, with your samples.) 9. After transfer, stain the membrane (PVDF or nitrocellulose) with 0.1% Ponceau S in 5% acetic acid (wash the membrane with distilled water 3 times and stain with the Ponceau solution for 5 min. Destain with distilled water. Protein bands should be visible immediately. It won't destain completely, just block with dried milk which will knock off the dye.) 10. Follow normal Western blot procedures, if you see nice protein bands.....

その後。 削除/引用 No.116-28 - 2007/09/07 (金) 10:49:33 - 6487 やっと、細胞が手に入ったので抽出しなおしました． >Do さん Doさんのいう通り抽出してみました．(6穴ウェルに1xSDS 30ul) かなりどろどろになったのですが、ソニケーションの装置がないので23Gの注射針で出し入れしました。ライセートはさらっとしていました． >えーっと さん >一度同じリシスバッファーやサンプルバッファーでBSAを調整して、SDS-PAGE（、CBB染色してみてはどうですか？ よく読んでおらず、lysis bufferを使わないで（MillQで希釈）、いつもの3xSDSとDTTだけいれてboilして流してしまいました．結果、CBB染色で高分子側に1本バンドが見えました(転写前)。 >細胞からの抽出が問題かもしれません。 前述したように新たな細胞を使って抽出しなおしました． 転写前のゲルのCBB染色でラダ−が確認されました。以下に詳しく述べます． ＊lysis buffer ・NP-40 100ul(4℃ store)/10cm Dish(これは通常) 　　(濃度不明。肝心なとこですが以前これでうまくいっていた。という理由で　　 教えていただけません) 　・protease inhibitor cocktail(-30℃ store)...1ul(1/100 vol) ・phospatase�T&�U(4℃ store)...各1ul(1/100 vol) plateをon iceにし、ウェルをダルベッコのPBS(-)で3ml(通常：5ml) x2 wash． 6穴ウェルに30ulのlysys bufferをかけ(通常：100ul)、すぐにセルスクレイパーでかき取り1.5ml tubeに移す．(通常：100ul のlysis bufferをかけ、適当に混ぜてから5min置いてからかきとる）on iceで行う． vortex 5min x3→13200rpm 4℃ 5min 遠心． 上清をnew tubeへ移す． （濃度測定へ（BCA assay:ピアス社）←今回はやってません） 10ulに対して3xSDS、DTTを加え、95℃でboilし、12.5% gelにアプライしました． もらった細胞の関係上、書き方がややこしくてすいません。 この方法でCBB染色でラダーがでました。 大きく違う点は、lysis bufferをかけてすぐにかきとった点でしょうか･･･． 結果･･･．出ません･･･． もうホントにあほなんですが、裏表を間違えた可能性を否定できずやり直して今日、detectします。

少し気になった点を 削除/引用 No.116-27 - 2007/09/06 (木) 15:49:03 - Yum 皆さんから様々なアドバイスを頂いているようですが，ここまで出なかった部分で気になったところがいくつかありましたので，的外れかもしれませんが一応記載してみます． 1. Lysisの際，10cm Dishに100ulのlysis bufferと記載されていますが，細胞回収後のペレットへの添加ならばともかく，Dishへ直接100ulでは少ないと感じます．ちゃんとLysisされてますか？ 2. Lysis後のサンプルに合計15分間もvortexをかける必要あります？． 3. 核内タンパクの検出とありますが，細胞質分画，核分核と分けてから泳動されているのでしょうか．分画の方法は適切でしょうか？ 4. DNA漏出による粘度上昇は解決されたうえで泳動されてますか？ 5. >だいたいreporobeしてからactin抗体をかけます. とありますが，strip用のバッファーは適切なものですか？．転写後直接アクチンを染められていたならばここの問題はなさそうですが． 6.タンパク濃度の測定に間違いはありませんか？ とりあえずいくつか気になった点を記載してみました． わずかでも解決の糸口となれること期待致します．

(無題) 削除/引用 No.116-26 - 2007/09/05 (水) 17:35:36 - 細胞屋 ＞私も細胞からの抽出からやり直したいのですが、 ＞新しい細胞をてにいれるのが非常に難しい状況にあるため、 　とのことですが、そもそもactinすら染まらない原因を考えるのなら、 　そちらのラボにある2種類の培養細胞のどちらかを起こして、 　特に処理など行わずに適当な大きさのdishないしwellにまいたものからサンプル調製して、 　actinを染めればよいのではないでしょうか？ 　まさか研究室の細胞株が根こそぎ尽きたわけではないんですよね？ 　「新しい細胞を手に入れる」という意味がよくわかりません。

二次抗体用バッファ 削除/引用 No.116-25 - 2007/09/05 (水) 17:09:47 - 6487 >APHRP さん レス、ありがとうございました。 >二次抗体用バッファは用事調整していますか？ 古いバッファに雑菌が生えるとAP検出のバックが高くなりますし、防腐剤としてアザイドを入れたものを使うとHRPが失活しますよ。 いえ．していません． いつも、1次抗体前のBlocking bufferを冷蔵保存しておいて、それを希釈に用います．残ったbufferも冷蔵保存してreprobe前のBlockinに使用したりしています． 確かに、milk/PBSだとかびやすいと言っていました．が、Tweenをいれるとかびないと言われ、これまでも問題なかったようなので使いまわしています． それから、アザイドとはアジ化のことでしょうか･･･． アジ化Naのことでしたら、使用しておりません．

(無題) 削除/引用 No.116-24 - 2007/09/04 (火) 19:33:11 - えーっと 通常、細胞をライゼートを調整後、すぐにサンプルバッファーを加えて保存した場合、全体としてのタンパク質の分解はほとんどないと思います。ライゼート調整後、室温で一晩とかほっておくとプロテアーゼによってダメージを受けるとは思いますが・・・。 あと、サンプルの凍結誘拐ですが、３回程度ならまったく問題ないです。１０回ぐらいやっても変化は少ないと思います。 なので、タンパク質分解というのはほとんどないと思います。 それよりも、抽出方法がうまくいってなくてほとんどタンパク質が取れてない可能性のほうが高いと思います。 一度同じリシスバッファーやサンプルバッファーでBSAを調整して、SDS-PAGE（BSAは１００、５００、１０００、２０００ngで流す）、CBB染色してみてはどうですか？もしきちんと流れれば、リシス・サンプルバッファーはSDS-PAGEに影響は及ぼしてないと思います。細胞からの抽出が問題かもしれません。 細胞からの抽出方法をより詳しく書かれてみてはいかがでしょうか？ 皆さんの意見を聞けると思います。

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