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(無題) 削除/引用 No.108-11 - 2007/08/26 (日) 00:10:41 - Cup みなさん、色々とアドバイスとご意見を頂き感謝です。早速週明けにEcoRI以外の酵素で確認し直してみます。このサイトは色々と勉強になり大変ありがたく思っています。初心者である私の質問にまでお付き合い下さった事を嬉しく思っております。どうもありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.108-10 - 2007/08/25 (土) 14:33:47 - a Cupさん 既に他の方が書かれていますので重複になりますが、私ならPCRとEcoRI以外の酵素で再度確認すると思います。 pGEM-Teasyでの経験ですが、このベクターも両側にEcoRI siteがありますが、片側のEcoRIが削れているクローンを得たこともあります。 とりあえず、insertが入っているのかPCRでチェックするのが楽だと思います。私の場合、出てきたコロニーをPCRしてinsertが入っているものを、mini-prepで確認しています。

(無題) 削除/引用 No.108-9 - 2007/08/25 (土) 14:08:56 - Cup ape さんのご指摘のように、まず他の制限酵素で切って確認してみようと思いました。1箇所で切断できるもので、5.5kb付近に1本でバンドが出てくるのか、などなど。

(無題) 削除/引用 No.108-8 - 2007/08/25 (土) 14:03:58 - Cup ape さん、カナマイシンさん、早速のアドバイスをありがとうございます。 カナマイシンさんの、＞２本鎖が１本しか切れてないOCC型（２）の可能性がある事は知りませんでした。インサートDNAを入れていないコントロールではベクターサイズと同程度の3.5kb付近の一本だけでしたので、EcoRI は効いていると思っておりました。またコントロールとサンプルは同時に泳動しており、コントロールのサイズからマーカーとの塩濃度が揃ってるのでは？とも思っております。2本のバンドは5.5kb付近のバンドの方が若干太いですが、2本ともスメアではなくはっきりしております。しかし2.0kb付近には薄い影すらありません。1本鎖でも切れていれば、2kb付近にもバンドが出てきても良さそうなのですが、どういうものなのでしょうか？こういう事はあまりないのでしょうか？初心者ならではのありがちな失敗で、もしこういう失敗の可能性がありそうでしたら、アドバイスを頂けると助かります。

(無題) 削除/引用 No.108-7 - 2007/08/25 (土) 13:59:46 - カナマイシン ape様。一部かぶってしまいました。すみません。

(無題) 削除/引用 No.108-6 - 2007/08/25 (土) 13:51:31 - カナマイシン 妙なバンドが出た場合 （しかも本人が初心者と仰るのであれば尚更ですが）、 「制限酵素で切れてない」ことをまず疑うべきと思います。 大前提として、プラスミドを泳動する場合、 ・２本鎖が２本とも切れた状態である直鎖型（１）←理想 ・２本鎖が１本しか切れてないOCC型（２） ・まったく切れてないCCC型（３） の３種類は異なった泳動位置に来ることをご理解ください。 （２）は必ず（１）より遅く泳動され、 （３）は泳動条件によって違う…んでしたっけ、確か。 Cupさんの泳動結果は、一例として以下のように考えられます。 ・インサートは入ってない。 ・精製したプラスミドの質、または酵素処理の質により、 （１）と（２）が混在している。（２）と（３）の可能性も有。 ・（１）は3.5 kb, （２）は5.5 kbの位置に見える。 もちろん一例にしかすぎません。 実際泳動写真を見るとまたアドバイスが違ってくると思うんですが… ２本のバンドの見かけ濃度比（大きいものほど濃く見える）は適切ですか？ 変な形のバンド（スメア型。まっすぐなバンドにならない）とかではない？ この２点を確認されるといいでしょう。

(無題) 削除/引用 No.108-5 - 2007/08/25 (土) 13:49:10 - ape 1.泳動速度の問題 EcoRIの反応産物をそのまま泳動しているのでしょうか。 マーカーとの塩濃度は揃えて泳動されてますか？ 2.EcoRIの反応がうまくいっていない ご存じでしょうが、プラスミドベクターはそのフォームによって泳動速度（距離？）が違います。5.5kbのバンドは、linearではないプラスミドの可能性はないですか？EcoRI以外の制限酵素部位は無いのでしょうか。有るのなら一度試してみてはどうでしょうか。あるいはコロニーPCRで確認してみてはどうでしょうか。 以上、月並みですが。

(無題) 削除/引用 No.108-4 - 2007/08/25 (土) 13:32:25 - Cup すみません。ベクターの名前を書き忘れました。 用いたベクターは、StrataClone PCR Cloning Vector pSC-Bです。

(無題) 削除/引用 No.108-3 - 2007/08/25 (土) 13:25:28 - Cup 舌足らずですみませんでした。 Insert DNA はgenomic DNA をテンプレートにしたPCR産物です。PCR産物のバンドサイズを確認した際は、予想通りに2kb付近に確認されましたので、そのままベクターへのinsert を試みました。用いたベクターはStrataClone blunt PCR cloning kit についていたベクターで、ligation 行い、ベクターへのインサートを試みました。このベクターにはinsert される部分の両側にEcoRI サイトが一つずつあり（２箇所）、当初はinsert DNA の両側の2箇所をEcoRIで切断した後にはベクターのサイズの3.5kbとインサートDNAのサイズである2kb付近の2つのバンドが検出される事を期待していたのですが、得られた結果はなぜか5.5kb付近とベクターサイズ程の3.5kb付近にバンドが出てきました。もし3.5kb付近に1本のみ検出されたのであれば、単なるインサートができていないと思って終わるのですが、どうして5.5kb付近のバンドが出てくるのかが分かりません。コンピテントセルにトランスフォーム後、LB agar plate に塗る前に、Xgalを処理し、２つのバンドが得られたコロニーは白と薄い青みがかった白いコロニーをピックアップしました。それとEcoRIの処理は37℃で１時間行いました。なにかヒントが得られたらと期待してここに投稿させて頂きました。何か良いアドバイスをお願い致します。

(無題) 削除/引用 No.108-2 - 2007/08/25 (土) 13:05:47 - a > 最近クローニングしてきた2KbのDNAを3.5Kbのベクターにインサートしようとしました。コンピテントセルにトランスフォームし、LB培地で増幅後、ミニプレップで精製しました。そしてアガロースゲルを用いてバンドサイズを確認したのですが、5.5kb付近と3.5kb付近にのみバンドが確認され、2kbの辺りにはバンドが存在しませんでした。このような時には一体何が起こっているのか、また今後はどのような対処でこの問題を解決すべきかが分かりません。私は初めてこのような実験をしたので経験がありませんが、このような事は良くある事なのでしょうか？今回3サンプルとも同じバンドの出方を示しておりました。なおインサートDNAを入れていない、いわゆるベクターだけのコントロールでは2つとも3.5kb付近にのみバンドが存在しました。どなたかアドバイスをお願いします。 まず、insertはPCR産物それとも別のものですか？vectorは何ですか？ mini-prep後、plasmidは制限酵素で切断して、チェックしたんですか？ 制限酵素は何ですか？ もう少し詳しく過程を書いていただけると、アドバイスできるかもしれません。

ベクターへのインサート 削除/引用 No.108-1 - 2007/08/25 (土) 11:13:01 - Cup 極めて初心者です。教え欲しい事があります。 最近クローニングしてきた2KbのDNAを3.5Kbのベクターにインサートしようとしました。コンピテントセルにトランスフォームし、LB培地で増幅後、ミニプレップで精製しました。そしてアガロースゲルを用いてバンドサイズを確認したのですが、5.5kb付近と3.5kb付近にのみバンドが確認され、2kbの辺りにはバンドが存在しませんでした。このような時には一体何が起こっているのか、また今後はどのような対処でこの問題を解決すべきかが分かりません。私は初めてこのような実験をしたので経験がありませんが、このような事は良くある事なのでしょうか？今回3サンプルとも同じバンドの出方を示しておりました。なおインサートDNAを入れていない、いわゆるベクターだけのコントロールでは2つとも3.5kb付近にのみバンドが存在しました。どなたかアドバイスをお願いします。

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