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遠心2 削除/引用 No.998-11 - 2008/04/23 (水) 10:53:53 - mom-a 前述の日本組織培養学会の質問箱では「1000rpm程度で遠心」となっているので、おそらくその程度でもOKであろうと書きました。（質問者の意見ではなくヒューマンサイエンス研究資源バンクの先生の回答です。） 実のところ、私は800rpm, 5minで遠心していましたが、他のラボで1000rpm, 3minという人もいまして、こちらも特に問題はなかったようです。 （本当はgを計算して記載しなければならないところですが、rpmでの表記が結構多いのは、一般的（？）なスイングローターで径が大体同じであることを想定しているのでしょう…ということで、今回もズボラをして申し訳ありません。） 組織培養学会のページによると、HL-60のトラブルはほとんどが解凍時の増殖が悪いことに集中しているそうです。順調に増え始めるまで時間がかかりますが、増え始めれば、通常の継代ではさほど問題は起こらないと思います。

(無題) 削除/引用 No.998-10 - 2008/04/22 (火) 17:22:07 - おお >[Re:8] 細胞の初心者さんは書きました : > 遠心に関しては、 > （間違っているのかもしれませんが）解凍後培地にサスペンドした後で1000rpm程度で遠心しています。 一度gを計算してください。上限1000gぐらいと考えていいかと思います。私はどんな細胞を扱う時もできる限り弱い遠心でと心がけています。実際700ー800gで十分大抵の細胞は落ちてきます。

遠心 削除/引用 No.998-9 - 2008/04/21 (月) 17:03:49 - mom-a ＞（間違っているのかもしれませんが）解凍後培地にサスペンドした後で1000rpm程度で遠心しています。 その程度なら大丈夫だと思います。解凍はなるべくすばやくした方が良いです。 凍結時の血清は20％でも良いかと思いますが、10％ではいけないというほどでもないような気がします。 細胞が増えて培地の色がかわってくるくらいまで何もしないで放っておくのが一番。一旦順調に増えだせば、後はそんなに気を使わなくてもガンガン増えてくれるはずです。適当に薄めればいいだけなので継代も楽チンです。最初の2週間程度は我慢、我慢。

(無題) 削除/引用 No.998-8 - 2008/04/21 (月) 14:30:00 - 細胞の初心者 遠心に関しては、 （間違っているのかもしれませんが）解凍後培地にサスペンドした後で1000rpm程度で遠心しています。 その後、上清を吸い取り、新しい培地に再度サスペンドして培養を開始しています。 ただ、ある程度細胞が増えてきたと思ったときにも、遠心していたので、 そのせいで細胞にダメージが及んだのかもしれません。 皆様の意見を参考にして、再度培養を開始したいと思います。 ありがとうございました。

追加 削除/引用 No.998-7 - 2008/04/21 (月) 14:10:22 - mom-a ~さんのおっしゃるように、遠心にも弱いようですので、DMSOを除くための遠心は必須（分化してしまうので）ですが、なるべく遠心しない方が良いようです。 解凍してしばらくは死細胞が混ざっていますが、順調に増殖するようになれば死細胞はほとんどいなくなります。それまではなるべくいじらない方が良いようです。継代時も遠心せずに、（順調に増えてくれば1：10くらい。増殖たイマイチなら少し濃い目）で単純希釈します。

(無題) 削除/引用 No.998-6 - 2008/04/21 (月) 13:24:10 - ~ 私もmom-a さんと同様のプロトコルでストックしています。 HL60は遠心に弱いので、多少死細胞が多くても、 (DMSOを除く遠心以外は)遠心せずに待ったほうがいいです。 はじめにFM3Aと同じくらい丈夫だと思って、2日に1回遠心して生きのいいのをとってこようとしたら、 どんどん細胞が死んでいきました

解凍後の注意 削除/引用 No.998-5 - 2008/04/21 (月) 11:48:03 - mom-a HL-60は解凍後の増殖が悪いので、その辺に問題がある可能性はないでしょうか？詳しくは日本組織培養学会の質問箱のページを検索してみると情報が出ていると思いますので、そちらで確認してください。 私の例では、↓な感じでした。 ・凍結はセルバンカーを使い、キムタオルでバイアルを包んで-80℃で凍結後、液体窒素保存。 ・解凍時は上清を遠心分離して除き、新しい培地（RPMI1640, 10%FBS）に懸濁。 ・最初は増殖が悪いので、増殖してくるまで7〜10日くらい培地交換せずに放置。（もちろん増殖してきていれば培地交換する。） ・順調に増殖するようになるまで2〜3週間かかりました。 解凍後しばらくは20%FBSでも良いようです。私の時はあまり変化がなかったので10%にしました。 解凍直後は細胞密度が高くなるようにした方が良いとのことで、フラスコの場合は立てる、ディッシュの場合は傾けるなどして底面積を小さくすることも有効だそうです。

(無題) 削除/引用 No.998-4 - 2008/04/21 (月) 05:33:55 - yt 高価な冷却用の容器を買わなくても発泡スチロールのチューブホルダーを2つ重ねて（穴の開いた面が向き合うようにして細胞が入ったチューブが穴に納まるようにする）テープでｷﾞｯﾁﾘ縛って、直接-80℃に入れるというやり方でも大丈夫です。

(無題) 削除/引用 No.998-3 - 2008/04/19 (土) 14:05:01 - おお http://www.atcc.org/ATCCAdvancedCatalogSearch/ProductDetails/tabid/452/Default.aspx?ATCCNum=CCL-240&Template=cellBiology ATCCをのぞいていみました。 バイチはIscove's Modified Dulbecco's Medium、20%の血清で完全な増殖が得られると書いています。増殖用バイチとしてRPMIなどを使っている人も少なくはないかと思いますが、、血清は10%で増殖させてますでしょうか?起こした直後だけでも血清を20%で飼うのもてかなと思います。 昔培養を習った時には10%DMSOで保存すると教わりましたが、ATCCは5%でのストックが標準のようです。 あと、確かに市販の細胞凍結用溶液のほうが安心かと思います(ものすごく優れているかは分かりませんが)。DMSOのメーカーがとか血清のロットがとかどうこうと考えてしまったりするかもしれませんので。 冷やし方はゆっくり、徐々に冷やすと言う事なので-20度に一度入れてもいいのですが、-20度になったころを見計らって-80度に移さないといけないので、結構ちゃんとコントロールできているか見極めるのが難しそうです。細胞凍結用の容器(中にイソプロをいれてイソプロが冷えていく特性を利用して徐々に冷やす丸い容器)とか売っていますので、それに入れて-80度にほりこんだ方が無難かもしれません。そこまでしなくても大抵の細胞株は大丈夫ですけど、あまりうまくいっていないようなので使ってみてる手はあるかと思います。 融解直後の細胞はなん% ぐらいが生存しているでしょうか。融解してバイチに移した時少しだけ採取して、遠心している間にでもトレパンブルーなどで生細胞を見積もってみてもいいかもしれません。問題点をクリアーにできるかもしれませんので。

(無題) 削除/引用 No.998-2 - 2008/04/19 (土) 12:32:22 - ats わたしもHL60細胞の凍結保存後の生存率が悪くて困ったことがありました。 血清濃度を変えたりしましたが改善されませんでした。 結局、セルバンカーを使えば、いきなり-80℃保存・一晩＞液体窒素に移動でも良好な結果が得られることが分かりましたので、現在は高価ですがセルバンカーを使っています。

細胞の凍結保存 削除/引用 No.998-1 - 2008/04/19 (土) 11:44:55 - 細胞の初心者 先日、凍結保存していたHL-60細胞を起こしたところ、まったく増殖しませんでした。 以前まで、付着系の細胞を使用していた際には、このようなことがなかったので、少し困っています。 凍結方法としては、10% FBSを含む培地に10% DMSOを加えたものでサスペンドし、４℃→-20℃→-80℃→液体窒素の手順で行なっています。 この方法では何か問題があるのでしょうか?それとも、浮遊系細胞の場合はことなるのでしょうか？ 教えてください。

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