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(無題) 削除/引用 No.994-2 - 2008/04/18 (金) 00:28:28 - TK-1 dyeをつかったsequencingではピークが1:1で現れても，dyeによって感度が違いますし，signal intensityはその周りの配列にもある程度影響されることがあるので，それを根拠に実験の根幹となるデータを取るのは余りにも安易すぎると思います。 RT-PCRはへテロマウス由来のmRNAを使ったと解釈してよろしいでしょうか？もしhomozygotesがlethalでないのなら，WTとホモから別々にRNAを取ってrealtime PCRで測定する方がまともだと思います。dyeをつかったsequencingではピークが1:1で現れても，dyeによって感度が違いますし，signal intensityはその周りの配列にもある程度影響されることがあるので，それを根拠に実験の根幹となるデータを取るのは余りにも安易すぎると思います。 ただこれはあくまでもmRNAレベルでの話で，実際のphenotypeに関わるのはプロテインレベルですから，もしその変異がプロテインの安定性や修飾に関わる可能性があるのなら，westernでみないと何とも言えないと思います。

変異ノックインアレルの発現定量 削除/引用 No.994-1 - 2008/04/17 (木) 23:49:10 - DSC 某遺伝子の変異ノックインマウスを作製しました。 missense point mutationをヘテロでもつマウスです。 Phenotypeとは別に、とりあえず変異アレルの発現量を調べることにしました。 変異を入れた以外、プロモーターなどはいじっていないので、 WTアレルと全く等しく（1：1で）発現していることを期待しています。 （薬剤耐性遺伝子を抜くためetc.のloxとFRTは1か所ずつ残っています） とりあえず、その転写産物をRT-PCRで増幅し （もちろんゲノムでなくmRNA配列を特異的に増幅できるプライマーで）、 得られたcDNA増幅産物をダイレクトシークエンシングしたところ、 変異導入部位にWTとmutationのピークがおよそ1：1のダブルで現れました。 これだけでは「変異アレルがWTアレルとまったく同じに発現している」ことを 証明するデータとしては不足でしょうか？ Allele-specific PCRのようなことでWTアレルと変異アレルの転写産物を 別々に定量RT-PCRとかできれば直接的な結果になると思いますが、 1ヌクレオチドしか違いがないので、特異的なプライマーを設計しても 従来型のTaqでは置換部位を乗り越えてしまうし、校正能のあるポリメラーゼでは ミスマッチ塩基を修復して伸長してしまいそうに思えます。 他に何かよい方法とかあれば、ご教授お願いします。

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