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(無題) 削除/引用 No.993-10 - 2008/04/21 (月) 14:33:16 - apoptosis ＞おおさん アドバイスありがとうございます。 確かにご指摘の通りなので、しっかりと考えてから実験を再開したいと思います。 今回は本当にありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.993-9 - 2008/04/19 (土) 14:42:47 - りょう よっしーさんへ： よっしーさんがイメージされるように、LDHはネクローシスでも放出されるでしょう。 あくまで、複数アッセイで相補的に考えないといけないと言いたかっただけです。 選択は個々人のavailableな検出機器・試薬などに依存します。

(無題) 削除/引用 No.993-8 - 2008/04/19 (土) 13:28:41 - おお >[Re:7] apoptosisさんは書きました : > みなさん、ありがとうございます。 > > 最初の質問時に書いていませんでしたが、実験に使用している細胞は基本的には増殖しないとされる血球系のprimalyの細胞です。 > そのせいで、MTTの結果がアポトーシスに反映しない可能性があるのでしょうか？ > 本当に基本的な間違いをしているのでしょうか? 問題点をもう一度冷静に見ていただきたいと思います。 一般論として細胞が増殖しないから、浮遊細胞または血球系細胞だからという理由などでMTTの選択が悪いとはいい切れないです。アッセイの選択しとして考えてもその段階では悪い考えとはいえません。 で実際に使う時に何をクリアーにしなければならないか、みなさんのコメントを読み返して今後の実験を判断されればいいかと思います。 大まかにわけて2点だと思います。 1)MTTが "あなたのの実験" で細胞数を反映してますか? 2)MTTで見積もられた細胞数の減少は "あなたの考えているアポトーシス" を反映してますか? とくに2)はそれぞれの実験で違いますのであなた自身で調べて考えるべき問題です。 たとえばあなたの使っている培養や刺激のコンディションでアポトーシスが起こるなら、細胞数でアポトーシスを見積もってもいいかもしれません。 ひと呼吸おいて、考えてみてください。

(無題) 削除/引用 No.993-7 - 2008/04/19 (土) 11:35:39 - apoptosis みなさん、ありがとうございます。 最初の質問時に書いていませんでしたが、実験に使用している細胞は基本的には増殖しないとされる血球系のprimalyの細胞です。 そのせいで、MTTの結果がアポトーシスに反映しない可能性があるのでしょうか？ 本当に基本的な間違いをしているのでしょうか? 以前には、付着系の増殖する細胞を使用したときにMTTを使用して、細胞数の評価をしていたもので・・・ また、「細胞数」以外での他の評価方法も参考になりましたので、これに関しては、もう少し追加実験をしようと思います。

(無題) 削除/引用 No.993-6 - 2008/04/19 (土) 09:32:45 - よっしー 便乗質問で申し訳ありません． LDHの放出はアポトーシスの指標になるのでしょうか？ ネクローシスでも放出すると思うのですが・・・． アポトーシスでLDHの放出が起こることすら知らなかったもので．

(無題) 削除/引用 No.993-5 - 2008/04/19 (土) 00:01:45 - りょう おお　さんの意見と一部かぶりますが、MTTは酵素活性を反映しているので、低値を示したからといって細胞数が少なくなったとも限らないですし、細胞数が少ないからといってアポトーシスが起こった結果であるとも断定できません。単なる増殖停止・単なる代謝活性減少などを見ている可能性が否定できません。 アポトーシスの指標となるものを２つくらい示してはじめて、MTTで見ていた差はアポトーシスを反映していたのだと総合的に理解できるのでは。annexin V染色やcaspaseの活性化、LDH放出、DNAの断片化など。 トリパンで良いのかは分かりません。

(無題) 削除/引用 No.993-4 - 2008/04/18 (金) 22:57:19 - ひまわり MTT assayの原理はご存知だと思いますが、apoptosisが起こっても発色する場合があります。（なぜ発色するか考えてみてください） 細胞毒性をみるときに、FBS(-)サンプル無添加の細胞をcontrolとして用います。MTT assayを行ったときにこのOD値よりも有意に低い場合、細胞死が起きていると解釈できます。

(無題) 削除/引用 No.993-3 - 2008/04/18 (金) 11:41:43 - おお MTTは細胞数を見積もる試薬ですが、細胞数を数える試薬ではありません。細胞ないの酵素の活性を利用して細胞数を推測しているわけです。ですから細胞の生理状態が変わると細胞あたりの活性が変わってくる場合があります。細胞の処理の仕方によっては正確に細胞の数を反映しない場合もあります。たいていの場合増殖の抑制や毒性による細胞の減少をMTTでアッセイできますが(実際していたことがあります)、ちょっと変だと思っていらっしゃるなら違う方法を取った方がいいかもしれません。 たとえば、細胞膜が壊れたことによりバイチ内に放出される酵素活性を測定して死細胞を見積もる方法何かもあります。もっと古典的な方法としては(特に接着細胞の場合、ウェルから細胞を回収してDNAを簡単に精製してその量をはかる(蛍光とかUVで)といった方法もあります。 http://www.bio-concierge.com/detail.php?id=5477 例えば刺激後細胞をカウントしてMTTの値がどれくらい相関しているかとか(6well用意して同じ処理で細胞数3ウェル、MTT3ウェル)、または実験に落度がないか確認してそうでないようであれば、測定方法を変更されてもいいかと思います。

(無題) 削除/引用 No.993-2 - 2008/04/18 (金) 01:01:07 - A 各wellの細胞数が上手く揃っていないのかもしれません。同じように 細胞を蒔いてそれが上手くいっているかどうかクリスタルバイオレットを 使って確認されてはどうですか？

MTT assay 削除/引用 No.993-1 - 2008/04/17 (木) 22:12:55 - apoptosis 現在アポトーシスの研究してますが、 アポトーシスの評価に関してMTTアッセイを使ったところ、まったくいい結果が得られませんでした。 自分は、フェノールレッドは含んでいる培地を使用し、バックグランドとしてcell freeの状態での数値を使用していました。 以前はトリパンブルー染色での評価をしていましたが、結果はいいと思うのですが、正直数値として得られた方がといい思い、他の評価としてMTTを選択しました。 他のアッセイに関しての結果は、一応は得られていますが、「アポトーシス細胞数」の結果が欲しいので。 アポトーシス細胞の評価に、トリパンブルーやMTTを使うのは適していないのでしょうか?もしくは、これらを利用している場合には、どのようにしていますか？ 皆様のご助言をいただけたらありがたいです。

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