>[Re:1] 初心者さんは書きました :
> 大腸菌を使ってのTA クローニング。
> インサートが入ってるかどうか，コロニーダイレクトPCRで確かめ
> シークエンスに進むかどうか，判断してます。
> レプリカって何ヶ月保存できるんでしょう。
> どなたか，経験談がありましたら。教えてください。
> お願いいたします。
レプリカにしろ、トランスフォーメーションしたコロニーにしろ2-3週間でしょうね。それ以上ほっておいても、大腸菌が増えることがありますが他の方が仰っているように問題が起こることがあります。せめてグリセロールストックまで持っていった方がいいですが、大腸菌が嫌がっているような配列や大きいプラスミドはグリセロールストックでもおかしくなってしまうことがあります。私はグリセロールストックよりも精製されたプラスミドを一番信用しています。
> 大腸菌を使ってのTA クローニング。
> インサートが入ってるかどうか，コロニーダイレクトPCRで確かめ
> シークエンスに進むかどうか，判断してます。
TAクローニングのあとコロニーPCRを使う理由は何でしょうか?でそのPCRフラグメントをシーケンスするのでしょうか。
わたしは,トランスフォーメーションやライゲーションを確実にワークするようにして、数個のコロニーを拾って、プラスミド精製までやってしまった方がトラブルが少ないと思います。プラスミド精製もキット(場合によってはロボット)化されていますのでコロニーの数が少なければキットを使っても短時間で精製できると思います。キットでなくても、SOLI、SOLII、SOLIIIのあとにいそプロで沈でんさせ遠心したペレットを保存しておけば、プラスミドとして保存しているわけですから保存後直ぐにプラスミドの確認に入れます。場合によっては10-20個のコロニーをふやし、そのうち4個ぐらいをプラスミド精製し、残りを念のためグリセロールストックしておくというのでもいいかもしれません。
コロニーPCRはステップが増えるだけであまりメリットがないと思ってます。さらにそのPCRのフラグメントをシーケンスしても、最終的に精製したのプラスミドのシーケンスといい切れないですし。
勿論実験によりますので参考までということで。 |
|
このスレッドをはてなブックマークに追加