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(無題) 削除/引用 No.971-8 - 2008/04/17 (木) 11:17:14 - おお >[Re:7] あべちゃんさんは書きました : > おおさま、 > 多くの情報を頂きありがとうございました。 > それぞれの利便性、問題点を指摘いただきありがとうございました。 抗体のバックグランドの話は私の個人的な感想なので、実験系によっては意見が異なるかもしれませんのであしからず。

(無題) 削除/引用 No.971-7 - 2008/04/17 (木) 09:39:10 - あべちゃん あがさま、 invitrogenのホームページを拝見しましたところ、P2指定の旨、書いてありました。私のところでは、P１までしか使えないので、助かりました。 ありがとうございます。 おおさま、 多くの情報を頂きありがとうございました。 それぞれの利便性、問題点を指摘いただきありがとうございました。 ハタ坊さま、 FLAG抗体に関して補足していただきありがとうございます。 やはり、生理学的な影響はケース・バイ・ケースなので、HA FLAGをC末端につけたものを同時並行で進めてみようと思います。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.971-6 - 2008/04/17 (木) 03:44:08 - おお >[Re:5] ハタ坊さんは書きました : > >抗体のなかでFLAG M5はCa依存性なので、FLAGM5アガロースやプロテインA/Gを使って抗体でトラップしたあと。EGTAなどのキレーターで溶出できますので、ネイティブなコンプレックスの単離が容易だと思います。 > Ca依存性なのはM1なのでは・・・。 失礼しました、確認せずに書いてしまいました、記憶があいまいだったかもしれません。シグマのカタログなどでご確認ください。混乱させてすいませんです。

(無題) 削除/引用 No.971-5 - 2008/04/16 (水) 23:02:32 - ハタ坊 >抗体のなかでFLAG M5はCa依存性なので、FLAGM5アガロースやプロテインA/Gを使って抗体でトラップしたあと。EGTAなどのキレーターで溶出できますので、ネイティブなコンプレックスの単離が容易だと思います。 Ca依存性なのはM1なのでは・・・。

(無題) 削除/引用 No.971-4 - 2008/04/16 (水) 20:12:14 - おお あと、タグの影響はそのタンパクの生理的な作用を確認するのが妥当なのではと思います。

(無題) 削除/引用 No.971-3 - 2008/04/16 (水) 20:03:52 - おお HISx6に対する抗体はそんなに感度が強くない印象があります。また、哺乳動物のタンパクは意外とHISリッチなタンパクが結構見つかりなかには6こぐらい並んでいるのも少なくはないので特異性という意味でも問題があります。メリットとしてはHISカラムが使えるので生化学的なアプローチがしやすい場合があります(大量のたんぱく質、タンパク複合体などの)。 HA、Mycはバックグランドの比較的ない抗体があるようです(ウエスタン、免疫染色とも)。抗体も昔からあるものなので、各社扱っているためか値段もそこそこ安くでてに入ったりするのではとも思います。ただしMycは内在性のmycを認識する可能性があります。エピトープぶいはヒトmycを使っていて、ヒト特異的(マウスやCOSなどではクロスリアクトしない)なものが大抵ですので、細胞を選べばいいわけですが、ヒトを使う時は要注意です。ネガティブコントロール、裏をとる実験など少し慎重にやるべきだと思います。 FLAGはHAやmycに比べて若干バックグランドがでるようなきがします。抗体のなかでFLAG M5はCa依存性なので、FLAGM5アガロースやプロテインA/Gを使って抗体でトラップしたあと。EGTAなどのキレーターで溶出できますので、ネイティブなコンプレックスの単離が容易だと思います。 とくのHA、myc、FLAGはゲル、磁気ビーズ坦体にコンジュゲートとしたものや、蛍光色素をつけたものなど幅広い商品が出そろっているような気がします。 V5は使用経験がありません。抗体などそれなり物はインビトロジェンがとりそろえていると思いますが、バリエーション(色素コンジュゲートなど)としてはどうなんでしょうか、、、 HA、myc、FLAGのタンパク複合体における影響は、一般論としてN、C末での違いの可能性は指摘できますが、ターゲットが違えばタグの影響も違ってきますしなんともいえないですが、幅広く使われているという意味では少ないのではと思えます。 あとGFPなどのでっかいものをでタグをつけるとIPが確実にできるようになりますが、複合体が不完全なものになる可能性が否めません。

V5エピトープタグ 削除/引用 No.971-2 - 2008/04/16 (水) 17:33:56 - あが 私はインビトロジェンのV5エピトープタグ付きのベクターを使おうと計画していたのですが、V5エピトープタグは今年の２月からクラス２に分類されることになったので、場合によってはP1での実験ができなくなったらしいです。みなさんはどのように対応されてますか？

エピトープタグについて 削除/引用 No.971-1 - 2008/04/16 (水) 11:50:11 - あべちゃん 哺乳類培養細胞においてCMVプロモーターなどで一過的に過剰発現できるベクターを新たに購入しようと考えております。 トピックにありますようにエピトープタグも付加できるようにと考えているのですが、 HA His6-10 Myc Flag V5 など様々なタグがあり、かえって、どのような判断基準で選べば良いのか悩んでおります。 エピトープタグに対する抗体の善し悪し、細胞への生理学的な影響、標的蛋白質への生化学的な影響など色々とあると思うのですが、情報を頂けませんでしょうか？ 何に使うかによって違うと思いますが、一般的な情報として教えていただければと幸いかと存じます。 当面は、Co-IPする為に使いたいです。標的蛋白質が複合体に含まれているので、標的蛋白質の静電的な影響も気になります。

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