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(無題) 削除/引用 No.964-9 - 2008/04/17 (木) 14:05:09 - PCR初心者 おおさん、Pumpkinさん、詳しく教えていただいてありがとうございました。 今後、実験に役立てて生きたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.964-8 - 2008/04/17 (木) 13:11:06 - おお > > Taqポリメラーゼでは、突出末端の3'端にAを付加する反応は起こるのかということです。 > 起こらないと考えて良いと思います。起こるとしても非常に頻度が低くく、無視してもいい、あるいはせざる終えないぐらいではないかと思います。 ただし、5'突出末端であれば、フィルインし平滑からさらに１塩基ついた状態になるのではと思います。

(無題) 削除/引用 No.964-7 - 2008/04/17 (木) 12:06:00 - Pumpkin ＞Taqポリメラーゼでは、突出末端の3'端にAを付加する反応は起こるのか どういう出口を考えているのかが、やはりわからないんですが、3'突出末端に対してTdT活性のあるTaqを作用させてどうしたいのですか。例えば、ベクター側にTTという突出末端があって、どうしても挿入断片にAAを付けたいということでしょうか。cDNAの全長クローニングを講義などで習ったと思いますが、ベクターにTdTとdGTPでGポリマー形成、挿入断片にはTdTとdCTPでCポリマーを形成させてクローニングするといったようなストラテジーはありますが、このようなことをTaqでやろうというのは無理な話です。 それともPCR産物にたいして2nd PCRをした場合のクローニングを心配されているのでしょうか。PCRの原理をしっかりと理解されれば、そのような心配もないはずです。

(無題) 削除/引用 No.964-6 - 2008/04/16 (水) 12:35:06 - PCR初心者 回答ありがとうございます。 質問の意図がわかりにくかったと思います。 Taqポリメラーゼで、平滑末端PCR産物の3'端にAを付加する反応は起こります。 同様にTaqポリメラーゼでは、突出末端の3'端にAを付加する反応は起こるのかということです。 皆様の回答から、突出末端の3'端にはAは付加しないということになるのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.964-5 - 2008/04/15 (火) 22:17:53 - おお >[Re:1] PCR初心者さんは書きました : > TdT活性をもつTaqなどの酵素でPCRを行った後、更にTdT活性をもつ酵素でA additionを行った場合、末端のアデニンの3’-OHに更にアデニンが1つ付加し、最終的に末端に2つのアデニンが付加されることになるのでしょうか？ TdT活性をもつ酵素としてTaqのようなPCRの酵素を考えているのであれば付加されないと思います。もし付加されるなら、PCRが終わった段階で、いろんな長さの突出末端ができても不思議ではありません。 Terminal Deoxynucleotidyl Transferase(PCRの酵素でない)そのものを使うと、末端にポリTが形成されると思います。

(無題) 削除/引用 No.964-4 - 2008/04/15 (火) 21:06:39 - Pumpkin Taqポリメラーゼは3'端に（主に）Aを付加しますが、テンプレートが存在しない限り（存在しないので）さらなる付加は続きません。ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼの場合には付加していくので、TAベクターの自作の際にはddTTPを使うなどしてTの連結を阻止します。Taq ポリメラーゼの場合には平滑末端ベクターに対してdTTPのみを入れればTをひとつ付加してくれます。（質問者の質問の意図を知りませんが。）

PCR酵素のTdT活性について 削除/引用 No.964-1 - 2008/04/15 (火) 19:32:44 - PCR初心者 TdT活性をもつTaqなどの酵素でPCRを行った後、更にTdT活性をもつ酵素でA additionを行った場合、末端のアデニンの3’-OHに更にアデニンが1つ付加し、最終的に末端に2つのアデニンが付加されることになるのでしょうか？

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