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(無題) 削除/引用 No.961-3 - 2008/04/21 (月) 16:23:52 - asuki ハイブリ様 情報ありがとうございます。 in　situ＝in　situ　hybridizationです。 ミスで忘れていました。申し訳ありません。 こちらでは、Tweenを使用しています（0.05％） また10ug/mlで15分（P7）、20分（P21）ProK処理も行っています。 現在、TECAN社の自動in situ Hybridizationマシーンで この操作を行っていますのでちょっ特殊なのかもしれません。 以前はTSAを使用しない方法で、2 overnightハイブリを行って いましたが、現在では6hのみのハイブリです（プレハイブリ1hあり） 短時間で行えるというのがウリらしいので短時間になっています。 やはり、低温で長時間ハイブリさせる方が1番てっとり早いのですかね・・・

(無題) 削除/引用 No.961-2 - 2008/04/15 (火) 17:04:45 - ハイブリ in situ = in situ hybridization のことだとして、TSAに限らず一般的なS/N比改善法を。 ■プローブの標識に関して 実際に使用してみた感触だと、DIGの方がバックが出にくいです。 内在性のDIGというものは動物細胞では存在していないので。 DIGをプローブの標識に用いてみるのも一つの方法だと思います。 また、ビオチンよりも多次抗体を用いて増幅しやすいです。 ■hybridizationの条件に関して hybridizationの際にnonspecificにプローブがくっついてしまっている可能性もあります。これを改善するには、一般的に『温度を低く』『プローブの濃度を低く』『hybridization bufferの塩濃度を低く』『時間を長く』するのが良いようです。 自分はhybridization bufferの塩濃度を低くし（5xSSC⇒2xSSC）、温度42℃で2日間incubateすることでかなりシグナルが強くなり、バックが減りました。 あとは、細かいところでいうと、TritonXの濃度を上げる・Proteinase処理をする、といった、『プローブが標的RNAにアクセスしやすくする』という処理を行うと多少シグナルが強まることがあるようです。

TSA使用のin situ 削除/引用 No.961-1 - 2008/04/15 (火) 15:19:38 - ASUKI 現在、パラフィン切片でTSAを使用時のin situの条件検討を行っています。 Perkin Elmer社のkitを使用しています。 シグナルの強い物に関しては問題なく使用できるのですが（少々バック高め） 本来の「弱いシグナルの物を増感させる」という意味では使用できていません。 アセチレーション処理、kit付属のBlocking以外にも 抗体と同じRoch社のBloking reagentも使用し、バックに弱いシグナルが 埋もれているのでは？という事で更に内在性のアビジン/ビオチンの Blocking kit（VECTOR社）を使用したところ、バックは大分落ちたのですが 弱い物の増感は認められません。 TSAを使用しないin situではProbe濃度が2ug/mlでほんのり出る程度でした。 現在はTSA使用時の濃度の倍1ug/mlで操作を行っているのですがダメです。 もし使用された事のある方がいらっしゃいましたら、 バックを上げすぎずに弱い物を増感させる方法などをご教授いただけませんか？ 宜しくお願い致します。

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