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御回答ありがとうございました． 削除/引用 No.959-5 - 2008/04/16 (水) 08:38:17 - saitama 皆様御回答ありがとうございます． 論文を読むべきだとは思っていたのですが， 素人なもので，どこから手をつけていいのか悩んでおりました． 私の対象はヒトです． データベースを教えていただけて助かりました． ある程度因子を絞っているので，少し調べてみます． それにしてもどの範囲を調べるかは悩ましい問題ですね．上流が次の因子までかなりあって調べきれそうにないので，近傍に絞って調べようかとも思っています． 少し調べてみて，またお伺いすると思いますが， 皆様宜しくお願いします．

(無題) 削除/引用 No.959-4 - 2008/04/15 (火) 12:15:41 - おお >[Re:1] saitamaさんは書きました : > １，ゲノム上のある遺伝子の上流の配列はどのように調べるのがよいでしょうか．NCBIのデータベースなどで簡単に調べられるのでしょうか？ BLASTなどで、エクソン1をつかって、その遺伝子の配列を含むコンティグ、BACやファージの配列を得ることができるでしょうし、遺伝子名からその染色体の上の位置からさらにナローダウンして配列を得ることもできると思います。私はENSEMBLEから遺伝子名などで検索して、ゲノムの情報をよく得てます(プロモーターでなくイントロンですが)。 http://www.ensembl.org/index.html > ２，遺伝子の発現制御に関わるのは上流のどの範囲かはどのように見分けるのでしょうか？上流何bpから何bpまでというような目安があるのでしょうか． 哺乳類が対象でしょうか。ショウジョウバエなどの場合は、遺伝子と遺伝子の間が比較的狭く、上流数キロを拾えばたいてい事足りるようです。哺乳類は全く分かりません。上流たしか50Kbぐらいの所にエンハンサーが見つかったりという報告があったりします。あるプロモーターを解析するため20kbをレポーター遺伝子(ルシフェラーゼ)につなぎ、けずりながらエンハンサー領域を絞り込んだという報告も読んだことがあります。エンハンサーはたまにその遺伝子のエクソンやイントロンに見つかることもあり、少しやっかいです。 可也の文献で上流5kぐらいから解析して報告されていますが、逆にいうとそういう所にある物が実験しやすいからそういう所から始めているともいえるかとおもいます 。 > ３，上流（プロモーター）の配列をクローニングする時は，普通にゲノムからPCRでよいのでしょうか．それともBACクローンなどからとらなければいけないのでしょうか． どちらでも基本的にはいいかと思います。PCRはエラーを考慮しないといけませんが、BACとかからきりだすとなると、切り出す部位が制限酵素認識部位に依存することになるかと思います。 > ４．一般的にある上流（プロモーター）の配列にどんな転写因子が結合するか簡単に予測する方法はありませんでしょうか． コンセンサスのマトリクスのデーターベースから、認識されうるサイトを見つけるWEBベースの検索ソフトがあります。すいません今直ぐに示せませんが、、ただ、転写制御因子のコンセンサスはあまり長くないので、100-200bpsにかならすなにか1つは見つかってしまうような頻度です。2kbpsぐらいに絞れていて、ファクターもある程度絞れているならば役に立つかもしれません。 古典的によるやる方法はDNAフットプリントでたんぱく質がついていそうな位置を調べることです。でその領域にコンセンサスがのっていたら、可能性が可也あるともいます。 私は現在プロモーターの解析から離れてしまっているので、実際の現場を知りませんが、もしかしたらp300やpolIIといったものでCHIPアッセイをしたら、エンハンサー領域を特異的にプルダウン出来るかもなんて想像しています

(無題) 削除/引用 No.959-3 - 2008/04/15 (火) 12:00:45 - Pumpkin 生物種がわかりませんが、ゲノムが公開されている種であればNCBIなどいくつかのデータベースから配列を入手できると思います。発現制御領域に関しては過去ログにも記述がありますので（上流だけでよいのかも含めて）、勉強がてら検索してみてください。私はおおむね1.5kb程度から始めます。クローニングはPCRからでも構わないと思います。転写因子の結合モチーフを検索するデータベースはいくつかあります。TRANSFACを私はよく使います。 この手に関しては恒常的に行われているストラテジーというものが存在していますので、同じようにプロモーター解析をしている論文をいくつか読まれることを激しくお勧めします。

(無題) 削除/引用 No.959-2 - 2008/04/15 (火) 11:52:46 - ドロちゃん 僭越ながら、回答させていただきます。 1. お使いのモデル生物は何ですか？ 全genome配列が判っているものであれば、Web上で調べられると思います。 2. 基本的に調節領域がどの範囲かはpromoterによって異なるので、一概には言えないと思います。 上流であることもあるし、intron内や遺伝子の下流ということも多いです。 現在私が関わっているpromoterでは、少なくとも上流35kbとintronの一部まで解析しないといけない状況です。 とはいえ、上流にある場合が多いとも思いますので、最初の戦略としては、上流をとってくるのが普通ではないでしょうか。 上流側の領域をデータベースなどで調べて、隣接する別の転写単位までの距離が近ければそこまでの範囲をすべてとってくる（もちろん、basalなcore promoter activityを残すため、下流側も少なくとも数十〜数百bpくらいは含んでいないといけない）といいのではないかと思います。 20kbくらいまでの長さなら、BACをtemplateにしてTaKaRa LA Taqを使えば簡単に特異的な断片が増やせます（10時間近くかかりますが）。 3. 短い断片をとるのであればgenomeからでも十分ですが、長い断片（10kb以上とか）なら圧倒的にBACをオススメします。 というか、BACが入手可能であるなら短い断片でもBACの方がいいでしょう。 非特異的なbandsが少なくなりますし、PCR error（これが一番厄介）の頻度も下がると思います。 4. TFSEARCHやTRANSFACといったWeb上のプログラムで調べられます。 配列を入力すると、putativeなprotein binding sitesを出力してくれます。 ただし問題は、既知のすべてのtranscription factorsをカバーしてるわけではないことと、アルゴリズムの違いによりプログラムによって出力される結果に相違がある場合がある点です。 なので、参考程度と思っておいた方がいいでしょう。 こんな感じですが、未熟者なので間違いなどありましたら申し訳ありません。

プロモーターの配列の解析に関して 削除/引用 No.959-1 - 2008/04/15 (火) 08:38:30 - saitama いつも勉強させていただいてます． 現在，ある遺伝子の発現に別の転写因子が関わっているのではと考え，プロモーターの解析をしようと思っています．そこで， １，ゲノム上のある遺伝子の上流の配列はどのように調べるのがよいでしょうか．NCBIのデータベースなどで簡単に調べられるのでしょうか？ ２，遺伝子の発現制御に関わるのは上流のどの範囲かはどのように見分けるのでしょうか？上流何bpから何bpまでというような目安があるのでしょうか． ３，上流（プロモーター）の配列をクローニングする時は，普通にゲノムからPCRでよいのでしょうか．それともBACクローンなどからとらなければいけないのでしょうか． ４．一般的にある上流（プロモーター）の配列にどんな転写因子が結合するか簡単に予測する方法はありませんでしょうか． 御存知の方がいらっしゃいましたら教えてください．宜しくお願いします．

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