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(無題) 削除/引用 No.956-12 - 2008/04/16 (水) 16:50:28 - ゆーさん 色々なアドバイスありがとうございました。 アドバイスを参考にして、もう少し頑張ってみます。

(無題) 削除/引用 No.956-11 - 2008/04/15 (火) 15:41:49 - 名無し 一般論ですが、抗原と抗体の結合は非常に強い事が多く、pH1〜3とか逆にpH11とか蛋白質の構造に影響するようなスレスレかけっこう厳しい条件でないとはなれないことがむしろ普通です。だからこのケースがとりわけ特別ではないと思います。競合溶出はどんなケースでも適用できるとは限らず、かりにうまく使えても回収率があまり良くないことが多いように思います。競合ペプチドとのインキュベーションを長くするとかするとある程度改善するかもしれませんが。抗体のS-S(特にLとHの間）はボイルとかしないと完全にはなかなか切れにくいので、還元剤もどんなもんかなあと思います。酵素がある程度じょうぶで変性条件にさらしても条件を戻せば活性を回復できるようようなら、すでに他の人が指摘されているように低いpHで溶出してすぐ中和とか、変性剤で溶出してすぐ希釈とかが現状では一番妥当な選択ではないかとおもいます。

(無題) 削除/引用 No.956-10 - 2008/04/15 (火) 14:27:48 - L この際、抗体を結合させたままでも、酵素活性が測定できる系を組み立てる、 というのもアリかと… もちろん、エピトープが活性中心に関わってこない、という前提ですが…

(無題) 削除/引用 No.956-9 - 2008/04/15 (火) 12:52:28 - おお イオン結合は高い塩濃度で外れる傾向がありますが、高い塩濃度だけでは外れない事を考えるとイオン結合だけではないんだろうなとかもいます。Mg++は3.5Mぐらいで、カオトロピックな作用が見られるのでそれで抗体抗原の相互作用を外すといったことはやられているようです。またLiClも同様な理由で使われることがあるようです(濃度は忘れました)。デタージェントをつかう余地はありませんでしょうか?酵素がそのデタージェントに耐性か調べないといけませんが、、、物によってはCHAPSなどで外れるものもあります。 あとどなたかおっしゃってますが、還元剤はアイデアだと思います。ただ数mMのDTTだけでは抗体は意外と平気だったりします。何かもうちょっと強い還元剤があればと思うのですが、ちょっと私の化学の知識が及びません。500mMとか使うともしかして外れるかなとか空想したりしているのですが、、 あと少し過激な方法としては1ー2M ぐらいの尿素です。尿素は非常に強力なカオトロピック作用をもっていて4M以上でほぼ完全な変性剤(同時に可溶化剤)として使われていますが低い濃度で結晶化用のたんぱく質の可溶化に使われたりすることがあるようです。

(無題) 削除/引用 No.956-8 - 2008/04/15 (火) 11:18:23 - ゆーさん Gly-HClの解離は試みてみました。酸性にすると、citrate、ベロナールNa-酢酸Naなどでも解離はするんですが、できればpHは６くらいまでで解離すればと考えています。 Mg2+は試していませんので、やってみます。 ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.956-7 - 2008/04/15 (火) 10:32:05 - L 酸(Gly-HCl, pH 2.5)ではがして、即時Trisで中和する というのはどうでしょうか？ それから、Mg2+などカオトロピック塩ではがす、というのもあるようです

(無題) 削除/引用 No.956-6 - 2008/04/14 (月) 23:34:02 - ＠ 素晴らしい抗体ですね・・・ってチャットか？ 今日は帰りますｗ

(無題) 削除/引用 No.956-5 - 2008/04/14 (月) 23:29:39 - ゆーさん NaClの濃度を１M、２Mとしてやってみましたが、それでも外れませんでした。 かなり頑固な抗体みたいです。

(無題) 削除/引用 No.956-4 - 2008/04/14 (月) 23:25:58 - ＠ パッとは思いつきませんが、DTTや２−MEで抗体のS-S結合はずすと抗原抗体反応は解離しないんですかね？試したことないので分かりませんし、酵素の方に悪影響与えないか心配でもありますが。 また、塩濃度を1Mとかに挙げても一度結合した抗原抗体反応ってはずれないかなあっと予想してしまいます。 他の人の意見を待ちましょう。

ありがとうございます 削除/引用 No.956-3 - 2008/04/14 (月) 23:13:16 - ゆーさん 酵素そのものを抗原にして免疫したので、エピトープは今のところ不明です。 Fab化すると結合力が弱くなるかなぁとは考えていましたが、 カラムに詰めるのに少なからず量が必要で、Fab化するのは金額的にちょっと大変です。 何かの合わせ技でうまくいかないでしょうか・・・

(無題) 削除/引用 No.956-2 - 2008/04/14 (月) 21:56:04 - ＠ エピト―プが分かっていれば、そのペプチドで競合溶出させる。 抗体をFabでしたっけ？Fab'2でしたっけ？にして親和性を弱くする。

タンパクの解離 削除/引用 No.956-1 - 2008/04/14 (月) 21:16:11 - ゆーさん ある酵素に対するモノクローナル抗体を作製し、酵素の精製を試みています。作製したモノクローナル抗体は、この酵素にたいして非常に結合が強く、精製に最適と思っていましたが、解離条件が非常に難しく、困っています。 今まで、エチレングリコール、DMSO、sucroseと色々と解離液を試したけどだめで、最終的にはpH３〜４の条件でのみ解離することが分かりました。 酵素は比較的低pHでも安定ですが、できれば中性領域で解離できればと思っています。 多分、イオン結合が非常に強いんだろうと考えておりますが、この結合をpH以外ではずす方法はないでしょうか？ よろしくアドバイスお願いします。

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