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(無題) 削除/引用 No.955-7 - 2008/05/23 (金) 10:16:41 - ちか 私の場合， Triton X : 0.5%　20 min 一次抗体：calbiochemのAb-5 二次抗体 : Anti rabbit-biotinylated IgG　&　Streptavidin-Alexa 488 これでうまく染まっています。 サンタクルズのc-fosはあまりいい思い出がありません。Ab-5に変えてから，私はうまくいくようになりました。

(無題) 削除/引用 No.955-6 - 2008/04/16 (水) 00:30:44 - おお 固定法を工夫されてはどうでしょうか? メタノール固定などはタンパクに直接架橋を施しませんし。 プロテアーゼを使って抗原部位にアクセスしやすいようにという方法もありますが、コントロールするのが難しくなってきます。あとはその抗体を使っている文献をいくつか集めてみてはどうでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.955-5 - 2008/04/15 (火) 12:53:06 - a つい最近、免疫染色を始めた未熟者ですが・・・ tritonを0.01%　5分にしておられるのは何か理由があるのでしょうか？ 0.1〜0.5%　10〜30分が一般的なようですが。 またこの抗体に関しては賦活化されていない方もおられるようなので、 特に問題にはならないかと。 固定法が正確に同じではないと思うので、断定はできませんが・・・。

(無題) 削除/引用 No.955-4 - 2008/04/14 (月) 23:43:04 - りょう 賦活化ということはパラフィンですか。 パラフィンで使用できる抗体でしょうか？ 凍結の方が素直に染まりそうですが。 WBでバンドが出てるということは反応性は確かな抗体なのでしょう。染色も同様にしようできるかどうかは、データシートに写真があるとのことですから、それもある程度保証済ですね。 データシートで使用している材料をポジコンにできませんか？ グリアだけでなく他の細胞も誘導かけてやってみてはどうでしょう。 あと、1次抗体・2次抗体をあてる時も血清とTx100を入れておいても良いのでは。GFAP抗体と種が異なるのなら、1次抗体を同時にあてても大丈夫です。（話それてますが）

りょうさん、ありがとうございます 削除/引用 No.955-3 - 2008/04/14 (月) 23:34:46 - いわぶち りょうさん、返信ありがとうございます。 刺激してまして、Westernでは明確な差が認められてます。 賦活化処理をしようか迷っている最中です。 Proteinase K処理やクエン酸処理をしないと核染色は厳しいのかなと。

(無題) 削除/引用 No.955-2 - 2008/04/14 (月) 23:31:53 - りょう 刺激しないとc-Fosって発現量少ないのでは？細胞質で染まっているのはバックグラウンドかクロスリアクト？

培養細胞でのc-Fos染色（サンタクルズ） 削除/引用 No.955-1 - 2008/04/14 (月) 12:18:34 - いわぶち 早速ですが、下記のプロトコルでc-Fos染色を実施しました。 核内に染色されると期待していたのですが、核は全く染まらず、細胞質に 特異的に染まっておりました。 対象はグリア細胞です。 Alexa488と633では殆ど重なることはありません。 4% パラフォルム 30min ↓ 0.01% Triton X 5min ↓ 1% Goat血清 30min ↓ c-Fos（サンタクルズ）, 1:200, 1day at 4℃ ↓ 60min 37℃ ↓ 二次抗体 rabbit 60min (Alexa 488) ↓ GFAP, 37℃　40min ↓ 二次抗体　mouse 60 min (Alexa 633) ↓ 顕微鏡 単に抗体が悪いのか（特異性が低い）、Tritonの時間が少ないのか 不明です。 パンフレットには核内に染まっている同抗体の写真があります。 ご存知の方がいらっしゃいましたら、教えて頂けませんでしょうか。 よろしくお願い致します。

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