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(無題) 削除/引用 No.954-7 - 2008/04/13 (日) 01:52:44 - 初心者 ご回答本当にありがとうございます。 タンパクAは、細胞内に入り作用するものなので、 ウエスタンなどでの検討を行い、濃度と時間を決めたいと思います。 類似の作用をするタンパクでの実験は見当たったので、それを参考にして、基準にする濃度は決めたいと思います。 時間に関しては、得られている結果から参考にしたいと思います。 これから何回かは条件を検討しなければなりませんが、本当に参考になりました。

(無題) 削除/引用 No.954-6 - 2008/04/12 (土) 18:30:55 - おお タンパクAはどの様に細胞に作用するのでしょうか?それによってやり方が変わってくると思います。増殖因子やサイトカインの様にリセプターをかいして、細胞に作用するのでしょうか?それとも何らかの理由で膜を透過して細胞ないに入り細胞内で作用するのでしょうか(最近はリコンビナントにTATーTAGをつけて細胞に取り込ませる実験系もポピュラーになってきています)。 後者の場合であれば、免疫染色やウエスタンで細胞内の取り込みを見て濃度を探っていけばいいかと思います。TATーTAGの場合は幾らか論文を探ってどのくらいの時間で取り込みが起こるか検討がつくと思います。 全く参考するものがない実験であれば、実験可能なMAXの濃度あるいは生理的な観点から有り得そうな濃度から数倍多い濃度、または似たような実験系で使われている濃度でMAXの濃度でタイムコースを大雑把に見れば良いかと思います。でも実験系がうまくいっているという根拠をどう取るかは問題があるところですが、それで動かなかったら、システムがワークしてないか、動かないかと言う事で違うアプローチをしないといけないかもしれません。 増殖因子やサイトカインの様な物であれば、表面につくそのたんぱく質の量を(間接的なリセプターの量)をまず調べると濃度が決まってくると思います。

(無題) 削除/引用 No.954-5 - 2008/04/12 (土) 14:31:26 - HT まずは、時間、濃度とも大雑把（出来るだけ極端な条件設定で）に振って、簡易なあたり実験をしてみてはいかがでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.954-4 - 2008/04/12 (土) 14:07:12 - ats この場合、調べたい時間というのが、タンパクAを作用させる時間（刺激時間）なのか、刺激後アッセイするまでの時間（反応時間）なのかが不明ですね。 私なら、（１）いろいろな濃度で培地に添加して（洗わずにそのまま培養し）「別の刺激でそれぞれ発現誘導される」時間で回収してアッセイします。もしくは、下記の目安時間参照に回収します。 そこで、誘導が最大になる最小濃度を決めます。 （２）その最小濃度で、回収までの時間をいろいろ変えて、誘導が最大になる時間（誘導最大時間）を決定します。 （３）最小濃度・誘導最大時間を一定にして、タンパクAを作用させる時間を変えていきます。 以上でグラフが3個できあがり。 反応時間の目安でまったく検討が付かないときは、(５分)、10分、30分、1時間、3時間、6時間、12時間、24時間でまず当たりを付けると良いでしょう。 もし、刺激X->タンパクA発現誘導->タンパクB誘導という図式が考えられるのなら、 siRNAなどでタンパクA発現を抑制した状態で、刺激X->->タンパクB誘導が抑制されれば、タンパクA->タンパクB誘導となる証拠の一つにもなるでしょう。

(無題) 削除/引用 No.954-3 - 2008/04/12 (土) 12:47:07 - 初心者 申し訳ございません。質問があまりにも漠然としていました。 使う予定のものはリコンビナントのタンパク（タンパクAとします）で、それを培養細胞に作用させることにより、別のタンパク質（タンパクBとします)の発現を確認する予定です。 タンパクAとBの発現は、別の刺激でそれぞれ発現誘導が確認できており、その時間も確認済みです。なので、両者の発現に相関があるか、AによりBが誘導されるかを確認したいと考えています。ただ、両者の確認は定量的な方法ではないので、それぞれの発現量はわかりません。また、時間も実際に作用させて細胞が取り込む時間などは分からない現状です。 なので、固定する方を時間にして濃度を振る方法を予定していますが、混乱しています。 まとまりのない文章ですいません。

(無題) 削除/引用 No.954-2 - 2008/04/12 (土) 10:35:57 - おお もう少し具体的に実験のことを書かれた方が(すべてでなくても)いいと思います。 一体何の試薬ですか?何かの酵素の阻害剤ですか?でそれを加えて何が見たいのですか?その酵素活性ですかそれともその酵素活性の阻害による生理的な変化ですか? もしお使いのものが酵素の阻害剤であるなら、濃度はその酵素が考えているシステム(動物、細胞、セルライセート)で阻害される濃度が最適な濃度ではないでしょうか。

時間と濃度 削除/引用 No.954-1 - 2008/04/12 (土) 09:02:48 - 初心者 今から、ある試薬の至適濃度と時間を検討したいと思います。 今までは、論文を参考にして、そこから決めていましたが、今回は参考になる論文が見つからないため、一から検討する予定です。 ただ、ここで濃度と時間どちらを最初に固定すればいいのか混乱してきました。 最初時間を固定して、濃度の影響を調べ、その後その濃度での時間を調べる予定なのですが、時間が外れていた場合には、濃度の影響も正確に分からない気がして、混乱してます。 どなたか助言をいただけると助かります。

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