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(無題) 削除/引用 No.953-9 - 2008/04/13 (日) 05:58:46 - 通りすがり >通りすがり様、どのような戦略で酵素を選んでいらっしゃいますか？ >お聞かせいただけると幸いです。 自分の場合、実は選ぶのも面倒で 最近では最初から複数の酵素でやって どれかの酵素が当たればいいか、という戦略で時間を短縮しています。 例としては、cloningの際はtemplate１種類に対して ８連のPCR tubeを用意してそれぞれのtubeに (Takaraが一番好きなのでtakaraの酵素ばかりですが) 1/5.Pyrobest 2/6.LA-Taq 3/7.Primestar Max 4/8.Primestra GXL (1~4がそのまま、5~8が1M Betaine+5% DMSOをadditiveとして添加) もうTmとか、それぞれの酵素の推奨条件などは はほとんど無視してanneal 55Cで設定して30cycleでやってみて 電気泳動して、収量が比較的あるものを選んでゲルから切り出します。 複数で増幅されてる場合、Fidelityの高いものを優先して(Prmstar Max>Pyrobest>=PrimstraGXL>LA-taq)、切り出すようにしています。 これら上記の戦略でダメな場合、隣のラボなどに頼んで AccuprimeおよびUltraPfuを試しますがここ２年ぐらいはこの段階には 行かなくなりましたね。 個人的な感想としてはPrimstarGXLでbetaine+DMSOを入れたものが 収量およびFidelityのbalanceで現時点でbestなようです。 この酵素でbetaineなどを加えているとゲノム(~500ng)からなら 下手すると15~18cycleぐらいでかなりクリアなbandが見えることが多く 重宝しています。

参考になりました。 削除/引用 No.953-8 - 2008/04/13 (日) 01:23:56 - PCR 皆様、ありがとうございます。 本当に参考になりました。 今回の場合は、必要な領域が決まっているので、そのまま気にせずにprimerを設計して、PCRを行ないたいと思います。 ただ、酵素の方を検討しなければなりませんが、目的配列を確認したところ、GCrichではなかったので、正確さを重点をおいた酵素を使用する予定です。 ちなみに、恥ずかしながら、DMSOのことに関しては、知りませんでした。 これに関しては、ぜひとも利用したいと思います。 また何かありましたら、宜しくお願いいたします。

(無題) 削除/引用 No.953-7 - 2008/04/12 (土) 23:23:50 - カナマイシン 横やりですが、大変参考になります。 というのも私もそれほど苦労したことがないので、 PCRの教科書に書いてあることを少し疑っていましたもので。 さて、私もおお様や通りすがり様と同じような戦略でPCRをルーチンでやっているのですが、 唯一通りすがり様の「酵素の変更」のみ考えたことがありませんでした。 我々はTakaraの酵素ばかり使ってまして、 エラーが入ってもいい増幅はExTaq、 入って欲しくない増幅はPrimeStar、というようにほぼ決めてかかってしまっています。 どうしても増えないときに両者を交換するときはあります。 通りすがり様、どのような戦略で酵素を選んでいらっしゃいますか？ お聞かせいただけると幸いです。

Re： 削除/引用 No.953-6 - 2008/04/12 (土) 20:42:01 - AC 　こんにちは。プロモーター領域と言うことで、GCリッチのせいでかかりにくいのかもしれませんね。GCリッチな領域には、やはりそれようの酵素を使うのも手です。以前、愛用していたTakaraのPrimeStarでかからなくて（大抵はこれで済む）、AccuTaqか何か失念しましたが、GCリッチ用のであっさり増幅できた経験があります。あるいは、すでに指摘にあるようにDMSOを追加するだけで、随分とかかりがよくなることがあります。具体的な濃度とかは検索すれば色々出てくるでしょう。 　プライマーのデザインは、それこそ、RT-PCRとかであれば、ネット上で自由に使えるPrimer3とかも候補でしょうが（すでに論文にあればそれを優先）、予め増幅したい領域が絞られている場合は、やはり感覚的に作成ですかね。プライマーが安価で入手できる昨今、条件検討はあまりしなくなりましたが、時間があるのであれば、Mg濃度や温度くらいは色々振って検討しても良いと思いますよ。

(無題) 削除/引用 No.953-5 - 2008/04/12 (土) 18:59:30 - おお >逆に全くバンドがでないときは,Primerの設計を考えるよりむしろ >酵素の種類を変えるだけです。PCRの条件もいちいち検討しません。 あ、私もPCRの条件は深入りしません。Mgの濃度とかいじる気もしません。念のため最初からDMSOを入れていることが多いのでDMSOなしでかからなかったら、DMSOをと言う事もないです。DMSOの代わりにベタインを使う人もいますが、、、 私もそう言う訳で条件よりもやはり酵素を変えますね。 と言う事で、プライマー設計ソフトなどは使ってません。だいたいここからここと決めて、そこで感覚的にプライマーを私も作ってしまいます。どこと決めるのはその範囲が必要であればあまり選択肢がないですし、制限酵素の認識サイトがあればクローニングしやすいでしょうし、制限酵素認識配列ずばり出なくても6塩基のの内5塩基がマッチしていたら、そこを制限酵素の認識する配列に変えたりしてプライマーを作ったりというのはよくします。一つだけ注意してほしいのは、プライマー領域が増幅する領域でくり返し配列になっているかどうかですが、なっていても最長のものを取るという手が取れる場合もあります。

(無題) 削除/引用 No.953-4 - 2008/04/12 (土) 10:53:54 - 通りすがり 昔はTmなどをいちいち気にしてましたが、 現在はPCRの酵素などの質が上がってきた部分もあって 全くといっていいほど気にしなくなりましたね。 増やしたい領域を自分で決めたらもう その配列そのものでprimerを作ってしまいます。 ORF全長ならそのものズバリで、ATGから始まってstopコドンデ終わるようなprimerの設計です。 二次構造やダイマーの形成などが可能性としてあるような配列でも cloning関係の場合は一切無視してます。 ２本のprimerでデザインしてTmが２０度ぐらい違うときもありますが なんだかんだいって、PCRはかかってきちんと 目的のものは増幅されることが多いです。 一年間に平均１００個ぐらいcloningしてますがだいたい９０％以上は 最近のLA-PCR用の酵素などを使えばどのメーカーでもまず増えてくれます。 おおさんのおっしゃってるように ようするにcloningの場合は、目的の領域さえ増幅されればよいので、 他に非特異なのがでても、同じような大きさの断片で 非特異なのがでる確率はゲノムをtemplateにしてる場合などなら ゼロに近いですし。 逆に全くバンドがでないときは,Primerの設計を考えるよりむしろ 酵素の種類を変えるだけです。PCRの条件もいちいち検討しません。 それでもダメな場合は１回のみprimerを設計しなおし(その場合少し外側にデザインし前回作ったのをNested　PCRにも利用できるようにしておきます)、通常のPCRで確認し、またダメならnestedでこれでもかからない場合は、そこで辞めます。時間の無駄ということでその領域の増幅はやめてしまい実験そのものの方向性を変えてしまいます。 おそらく細かく条件検討すれば改善されることもあるでしょうが 結局、時間と労力をどこまで費やすかの問題になってくると思います。

(無題) 削除/引用 No.953-3 - 2008/04/12 (土) 10:06:36 - おお あ、あとTmもあまり気にしてません。ある程度の長さにしておくとTmはほぼそろってくるだろうと勝手に理屈をつけてます。じっさい27以上にすることが多いです。

(無題) 削除/引用 No.953-2 - 2008/04/12 (土) 10:02:59 - おお 私は、必要なところ(きまった所)にプライマーを設計しないといけないことが多々あるので、プライマーダイマーができるとか、いちいち気にしてません。プライマーダイマーが理論上できるような状態でも、結構邪魔にならないばあいもあります。そういえば非常に小さいところに何か増幅が見られるなと思っても十分目的の物が増幅されていたりする事も多々ありますし。もし絶対にここからここと正確に決めなくていいのであれば、FとR2個づつつくると4通りの組み合わせができますし、その中に増えるのがあればOKというぐらいの考え方でいます。せめてFかRどちらかだけでも少し位置を変えて設定して3つにしとくといいかと思います。単なる組み合わせのうえ、ネスティドで拾うことが出来るかもしれないからです。 あとはテンプレートの工夫もきいてくると思います。必要な部分を含んだBACやファージを手に入れるとか、目的の場所を切断しない制限酵素できるとか、また制限酵素で切ったあとアガロースで電気えいどうなどでながして、目的の物がある長さのところを回収するなど、いろいろ工夫されている方がいるようです。

Primerの設計 削除/引用 No.953-1 - 2008/04/12 (土) 08:52:22 - PCR 以前に、別トピで質問した者です。 promoter領域の解析を行なうためにprimerを設計してるのですが、 目的の配列でどうしても好ましい配列（duplexやヘアピンを作らない）やTm値のプライマーが設計できません。 以前に、mRNA全長をクローニングする際にも、なかなか決まらなくて、設計したprimerがうまく機能しなかったりで、かなり時間がかかった経験があります。 みなさんは、どのようにprimer（特にpromoterやfull mRNA）設計していますか? 特に全長の場合には、Tm値などの条件を考えずに、開始コドンからスタートして終始コドンまでにあたるように設計していますか? また、仮にTm値が異常に高いPrimerを使用する場合は、どのような条件でPCRをかけていますか? やはり地道な条件検討しかないのでしょうが、 初心者などで、質問も分かりにくいでしょうが、お願いします。。

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