BioTechnicalフォーラム [WBでN-cadｈｅｒｉｎのbandがでません。]

WBでN-cadｈｅｒｉｎのbandがでません。

No.948-TOPIC - 2008/04/11 (金) 13:55:30 - 困ってます

お世話になります。

ratの腎から蛋白を抽出し、N-cadherinのWestern　blottingを行ってますが、bandが検出されません。

コントロールのβ-actinのbandはでます。
ともにマウスのモノクローナル抗体です。
N-cadherinの抗体の濃度が薄いのではと思い、濃度をふってみたりしたのですがだめでした。

抗体は組織の免疫染色で染まることを確認していますので、抗体がだめになっているということはなさそうです。

以前、E-cadherinのWesternをしたときはきちんとbandがでました。

なぜ、でないのかわからず行き詰ってます。
なにかおかしいのでしょうか。アドバイスいただけたらうれしいのですが・・・よろしくお願いいたします。
　

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No.948-8 - 2008/04/14 (月) 10:08:38 - ~

>Nativeなタンパク質とはどういうことですか？
>Nativeなタンパク質しか検出できない抗体とは、どういうことですか？

抗体によっては、タンパク質の高次構造を認識している場合があります。
この場合は、タンパク質をSDS化して、直鎖状にした場合には検出できなくなります。

>免疫組織染色には使えるが、タンパクを抽出したりしてWBすると使えないということなのでしょうか？

そういう抗体がありますので、質問される場合には、WBで認識できるものなのかの情報が必要になります。

>N-cadherinの抗体はBD　transduction　Labのもので、データシートにじゃWBにも使えるとありました。

この情報が上記の回答になります。

>E-cadherinもN-cadherinも細胞膜に発現するので、N-cadherinも同じようにできると思ってました。

タンパク質の局在や配列と、抗体の認識部位は別ものですので、
似たタンパク質で出来たということはほとんど参考になりません。

>昨日、発光時間をかなり長くしてしてみましたら、目的とするところに、うっすらバンドがみえたので、
>もう少しいろいろためしてみます。

BDのデータシートを見ると、コントロールとして、Cerebrum Lysateが勧められていますね。
各臓器でのタンパク質量がどのようになっているのかは私は知りませんが、
腎臓を取るついでに、大脳もとって、一緒に流してみてはいかがでしょうか。

(無題)

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No.948-7 - 2008/04/14 (月) 09:08:39 - 困ってます

いろいろアドバイスありがとうございます。

初心者で、まわりに聞く人もあまりいないので・・・
ほんとに助かっています。

Nativeなタンパク質とはどういうことですか？
Nativeなタンパク質しか検出できない抗体とは、どういうことですか？

免疫組織染色には使えるが、タンパクを抽出したりしてWBすると使えないということなのでしょうか？

N-cadherinの抗体はBD　transduction　Labのもので、データシートにじゃWBにも使えるとありました。

E-cadherinもN-cadherinも細胞膜に発現するので、N-cadherinも同じようにできると思ってました。

昨日、発光時間をかなり長くしてしてみましたら、目的とするところに、うっすらバンドがみえたので、
もう少しいろいろためしてみます。

ありがとうございました。

(無題)

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No.948-6 - 2008/04/11 (金) 18:24:04 - sea

まだ行き詰る、というほど八方手を尽くしたり情報を
集められたのかどうか、文面からだけでは判断できませんが、
下記の点についてチェックされてはいかがでしょうか？
(重複もありますがご容赦ください)

(1) Antibody application
データシートでの抗体の適用はどうですか？
「ラット」で「WB」に使えるかどうか、が重要です。
もちろん、メーカーが書いていないapplication, cross reactivityを
示すことも多々ありますが、まずはそこの情報がほしいところです。

(2) sample preparation
サンプルは腎臓全体を取っているのでしょうか？N-cadherinの腎での
distributionは知りませんが、N-cadherin richな部分だけ利用して
タンパクを取ることはできませんか？

lysis bufferはN-cadherinを可溶化できるものですか？
発現量が少ないのであれば膜分画を精製できませんか？

"~"さんも書かれているように、還元・非還元状態の両方を試して
みましたか？

(3) その他
メーカーは信頼できるメーカーですか(^^;
それから、もしもメーカーがポジコンになるようなサンプルを提供、
もしくは情報だけでも提供しているようならそういうものを
利用することは出来ませんか？

同じ抗体を利用している論文があれば、そこでのmethodsは参考に
なりませんか？

ざっと思いつくところではこんな感じですが、
これも頻出なのであれですが、組織の免染に使えた抗体が
必ずWBに使えるわけではないので、お持ちの抗体がWBに使えない
可能性は否定できないです。

長くなってすみません。
ご健闘をお祈りします。

(無題)

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No.948-5 - 2008/04/11 (金) 17:56:44 - A

> そうであればN-cadherinはNativeなタンパク質でないと検出できないということはありませんか？

~さんがおっしゃるようにNativeしか検出できない抗体かもしれません
サンプルを直接Dotblotして確認してみては如何ですか。

(無題)

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No.948-4 - 2008/04/11 (金) 17:16:45 - ~

あれ、E-cadherinとN-cadherinは別の抗体で検出しているのでしょうか？

そうであればN-cadherinはNativeなタンパク質でないと検出できないということはありませんか？
メーカーのデーターシートではWBに使えると書かれているのでしょうか。

(無題)

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No.948-3 - 2008/04/11 (金) 17:02:07 - 困ってます

転写はうまくいってると思います。
N-cadherinは130KDaで、E-cadherinは123KDaです。
E-cadherinはうまくいきました。

腎でのN-cadherinの発現量が低いとおもうのですが、
免疫染色でもそまるので、検出できるはずとおもうのですが、
うまくいきません