あまりTベクターだからいけないとかTOPOだからどうだと言うのはないと思います。それぞれ使ったことはありますが、個人的にはベクターの端に制限酵素認識部位をつけ、普通のベクター(プラスミド)にほりこむか、たまにブラントでほりこんでしまうことのほうが多いです。Tベクターだと、PCRのフラグメントにAの突出末端をつけないといけないのでTaqで増やすか、Pfuなどの使った場合には、フラグメントをTaqでしょりしてAをつけないといけませんね。
マルチクローニングサイトの制限酵素が都合のいい物と言うのも選択に影響すると思います。
私はPCRクローニングでTaqはあまり勧めません。もちろん目的によりますが。結構ミューテーションが入ってあとから対処できるにしてもめんどくさいです。ミューテーションのはいってないのを見つけるためにクローンを増やすのも場合によっては手間になりますし。
>[Re:4] PCRさんは書きました :
> 横からすみません。一般論でいいので教えてください。
> 変異の入ったプライマーでプラスミドを一周するPCRして作った際、シーケンスはどの範囲を確認していますか？
これについては実験によって違ってくると思います。プロモーターアッセイのような場合は一見関係のないところ(例えばアンプのORFにサイレントミューテーション)が入っても問題になる可能せいがあります。必要な部分を確認して、プラスミドに挿入し直した法がいいと思います。
なにかたんぱく質の発現ベクターの目的のたんぱく質に変異を入れる時などは、これも目的によりますが、ORFの部分とその前後が確認できたらよしとすることが多いです。その上で2クローン取るようにしてます。2クローンで振る舞いが違う時は一方にバックボーンの重要な部分に何か変なことが起こっていると察しがつきますから。2クローンとも同程度に発現が低ければ変異を入れたためと思えますし。で、その時点で移し変えるかどうか考えます。
変異がそのタンパクの安定性に寄与していると言いたいのであれば、バックボーンはコントロールと一緒であるべきでしょうし、変異によって恒常的に活性化した状態になって発現が多少弱くなってもその効果がはっきりしている時はそんなにバックボーンにこだわらないかもしれません。 |
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